鄭 婷，甘麥鄰，李 強(qiáng)，鐘志君，張順華*，朱 礪*

（1．四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130；2．四川省畜牧總站，四川 成都 610041；3. 四川省畜牧科學(xué)研究院，四川 成都 610066）

動(dòng)物肌肉組織是人類(lèi)主要的蛋白質(zhì)來(lái)源之一，對(duì)于農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物，尤其是肉用家畜來(lái)說(shuō)，產(chǎn)肉是最重要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，動(dòng)物骨骼肌的發(fā)育情況直接決定了其產(chǎn)肉能力和肉品質(zhì)。脊椎動(dòng)物的骨骼肌細(xì)胞是一種經(jīng)過(guò)復(fù)雜的分化過(guò)程形成的具有收縮功能的多核細(xì)胞。在動(dòng)物胚胎發(fā)育的過(guò)程中，來(lái)自中胚層的祖細(xì)胞首先進(jìn)行增殖，隨后退出細(xì)胞周期在生肌調(diào)節(jié)因子（myogenic regulatory factors， MRFs）的驅(qū)動(dòng)下分化、融合成肌管，最終形成肌纖維[1-2]。通常根據(jù)肌纖維表達(dá)的肌球蛋白重鏈（Muscle heavy chains， MyHC）亞型的差異可將骨骼肌分為慢速氧化型肌纖維（MyHCⅠ）、快速氧化型肌纖維（MyHCⅡa）、快速酵解型肌纖維（MyHCⅡb）和中間型肌纖維（MyHCⅡx），肌纖維類(lèi)型決定了肌肉的運(yùn)動(dòng)能力和代謝類(lèi)型，同時(shí)還與畜產(chǎn)品肉品質(zhì)密切相關(guān)[3]。在豬中背最長(zhǎng)肌是典型的快速酵解型肌肉（又稱(chēng)白?。蠹榈湫偷穆傺趸图∪猓ㄓ址Q(chēng)紅?。4]。microRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)度約22nt的非編碼RNA，主要在其靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)控作用，近年來(lái)越來(lái)越多的microRNA被報(bào)道參與了骨骼肌的發(fā)育調(diào)控，如miR-1、miR-133、miR-206等[5]。miR-222在此前的研究報(bào)道中已被發(fā)現(xiàn)可以抑制骨骼肌細(xì)胞成肌細(xì)胞的分化[6-7]。但miR-222在豬骨骼肌中的表達(dá)及其是否調(diào)控豬不同骨骼肌肌纖維類(lèi)型的發(fā)育還未見(jiàn)報(bào)道。因此本試驗(yàn)以藏豬（地方品種豬）和DLY豬（外種豬）的背最長(zhǎng)?。ò准。┖脱蠹。t?。樵囼?yàn)材料，分析miR-222在背最長(zhǎng)肌和腰大肌的表達(dá)特性，以期為進(jìn)一步研究miR-222對(duì)豬骨骼肌發(fā)育和肌肉品質(zhì)的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雌性藏豬［體重：（54．60±5．5．56 ）kg，樣品取自甘孜藏族自治州畜牧業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖基地］和雌性DLY豬（樣品取自成都市某屠宰場(chǎng)）各6頭，分別取背最長(zhǎng)肌（LDM）和腰大?。≒MM）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取

稱(chēng)取40～50 mg肌肉組織研磨樣于1．5 ml離心管中，加入1 mL Trizol（Ambion） 充 分 裂 解 5 min， 隨后按照說(shuō)明書(shū)內(nèi)容進(jìn)行RNA提取。使用 Nanodrop2000核酸蛋白儀（Thermo Scientific）對(duì)RNA質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

分 別 使 用microRNA和mRNA 反 轉(zhuǎn) 試 劑 盒（TaKaRa）反 轉(zhuǎn)cDNA，qRT-PCR采 用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）試劑在CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）下使用 2_ΔΔCt法進(jìn)行檢測(cè)[8]，microRNA和mRNA分別使用U6和GAPDH作內(nèi)參。相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

1.2.3 靶基因預(yù)測(cè)

miR-222靶基因預(yù)測(cè)使用TargetScan和miRDB軟件，同時(shí)結(jié)合序列分析比對(duì)的方式進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)值采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20．0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-222在藏豬和DLY豬背最長(zhǎng)肌及腰大肌中的表達(dá)

由圖1可知，miR-222在藏豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著（P＜0．05）高于腰大肌，miR-222在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量是腰大肌的 1．40倍（圖 1．A）；miR-222在DLY豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著（P＜0．05）高于腰大肌，miR-222在背最長(zhǎng)肌的表達(dá)量是腰大肌的 1．51 倍（圖 1．B）。

圖1 miR-222在藏豬和DLY豬背最長(zhǎng)?。↙DM）和腰大肌（PMM）中的表達(dá)

圖2 miR-222與PGC1α結(jié)合序列圖示

表1 引物序列及反應(yīng)溫度

2.2 miR-222靶基因PGC1α的序列分析

如圖2所示，miR-222的種子序列與PGC1α的3’UTR區(qū)域2239-3245位序列互補(bǔ)配對(duì)。

2.3 PGC1α在藏豬和DLY豬背最長(zhǎng)肌和腰大肌中的表達(dá)

PGC1α在藏豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著（P＜0．05）低于腰大肌，為腰 大 肌 的 45．4%（ 圖 3．A）；PGC1α在DLY豬背最長(zhǎng)肌中的表達(dá)量顯著（P＜0．05）低于腰大肌，為腰大肌的53．7%（圖 3．B）。

2.4 miR-222與PGC1α表達(dá)量的相關(guān)性分析

進(jìn)一步對(duì)所有樣本miR-222和PGC1α的表達(dá)量進(jìn)行線(xiàn)性相關(guān)性分析，如圖4。得相關(guān)性方程為：Y=-5458．1X+2．5594（Y ：PGC1α ；X ：miR-222）；R2=0．65；P＜ 0．05。

3 討論

骨骼肌的發(fā)育受到相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的嚴(yán)格調(diào)控，microRNA參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制也影響著骨骼肌的發(fā)育。當(dāng)前研究表明一些肌源性microRNA（miR-1、miR-133和 miR-206）和非肌源性 microRNA（miR-378、miR-499、miR-152等）均在骨骼肌發(fā)育過(guò)程中扮演著重要角色[9-10]。此前已有研究發(fā)現(xiàn)miR-222可促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制其成肌分化[11]。但目前還未見(jiàn)miR-222在豬骨骼肌發(fā)育的相關(guān)研究報(bào)道，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-222在成年豬骨骼肌中存在中等程度（U6表達(dá)量的0．2%～0．5%）的表達(dá)，提示可進(jìn)一步對(duì)miR-222進(jìn)行功能性研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在藏豬和DLY豬中背最長(zhǎng)肌miR-222表達(dá)水平均高于相同豬種的腰大肌，背最長(zhǎng)肌是典型的白肌，腰大肌是典型的紅肌，miR-222在兩個(gè)豬種中具有相同的表達(dá)模式，暗示miR-222可能參與了豬骨骼肌類(lèi)型的轉(zhuǎn)換和調(diào)控[12]。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)DLY豬背最長(zhǎng)肌和腰大肌中miR-222表達(dá)水平均低于藏豬，藏豬是典型的地方品種豬，生長(zhǎng)速度和骨骼肌發(fā)達(dá)程度均不如DLY豬[13]。miR-222在骨骼肌更發(fā)達(dá)的DLY豬種中具有更低的表達(dá)模式也暗示了其可能參與骨骼肌發(fā)育調(diào)控，與此前在小鼠上的研究吻合[7，11]。

鑒于miR-222在兩個(gè)豬種的腰大肌中表達(dá)更低，我們猜測(cè)miR-222可能參與了骨骼肌肌纖維類(lèi)型和能量代謝的調(diào)控。而microRNA調(diào)控是一種經(jīng)典的表觀遺傳調(diào)控，其功能的發(fā)揮必須依靠其靶基因執(zhí)行。過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ輔助激活因子α(PGC1α)是一種轉(zhuǎn)錄輔助激活因子，在線(xiàn)粒體含量豐富和氧化代謝活躍的組織中高表達(dá)[14-15]。通過(guò)軟件預(yù)測(cè)和序列比對(duì)我們發(fā)現(xiàn)PGC1α的3’UTR區(qū)域存在miR-222種子序列的結(jié)合位點(diǎn)，暗示PGC1α可能是miR-222的潛在靶基因。進(jìn)一步我們檢測(cè)了藏豬和DLY豬背最長(zhǎng)肌和腰大肌PGC1α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在藏豬和DLY豬背最長(zhǎng)肌中PGC1α的表達(dá)量均低于相同豬種腰大肌，與miR-222表達(dá)模式相反，且與此前相關(guān)研究結(jié)果相似[16]。進(jìn)一步對(duì)PGC1α和miR-222的表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PGC1α與miR-222存在顯著強(qiáng)負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步提示PGC1α和miR-222的靶標(biāo)關(guān)系。

圖3 PGC1α在藏豬和DLY豬背最長(zhǎng)?。↙DM）和腰大?。≒MM）中的表達(dá)

圖4 miR-222與PGC1α表達(dá)量的相關(guān)性分析

4 結(jié)論

miR-222在藏豬和DLY豬的背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量高于腰大肌，其潛在靶基因PGC1α在藏豬和DLY豬的背最長(zhǎng)肌中表達(dá)量則低于腰大肌。暗示miR-222可能通過(guò)PGC1α參與了豬不同骨骼肌肌纖維發(fā)育的調(diào)控，但其靶標(biāo)關(guān)系還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。