曾旭健，包銀莉

（1.成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院，四川 成都，610030； 2.四川海林格生物制藥有限公司，四川 成都，610030）

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病 毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV）引起的一種豬急性、感染性腸道疾病，臨床上以患病仔豬嘔吐、水樣腹瀉、脫水、消瘦為典型癥狀。在我國，2010年前主要以散發(fā)為主。2010年后該病全面暴發(fā)，并呈現(xiàn)新的流行特征：患病仔豬出現(xiàn)更加嚴重的腹瀉、嘔吐和脫水癥狀，死亡率高達80%～100%。這些特征提示現(xiàn)行流行毒株與現(xiàn)有疫苗毒株可能存在較大的差異。文章從PEDV結(jié)構(gòu)、流行株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況、我國疫苗株基因分群情況以及流行株對疫病防控作用等多個方面對我國PEDV毒株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況進行分析，以期為豬流行性腹瀉的合理防控提供理論依據(jù)。

1 PEDV的結(jié)構(gòu)

PEDV屬于α-冠狀病毒，呈現(xiàn)典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)?；蚪M全長約為28kb，由至少7個開放閱讀框(ORFs)構(gòu)成，分別編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白（S蛋白、E蛋白、M蛋白、N蛋白）和3個非結(jié)構(gòu)蛋白（ORF1a，ORF1b，ORF3）。

2 流行株結(jié)構(gòu)蛋白遺傳變異情況

PEDV作為一種基因組較大的RNA病毒，容易發(fā)生核酸變異，導(dǎo)致新的變異株甚至基因型的出現(xiàn)。在PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白基因中，S基因的變異最大。

2.1 S蛋白

S蛋白是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，由1383個氨基酸（aa）組成。根據(jù) PEDV 與其他冠狀病毒S蛋白的同源性，可將S蛋白分為S1（1-789 aa）和S2（790-1383 aa）兩個部分。其中，S1是PEDV基因組的高變區(qū)域，包含多個中和表位和受體結(jié)合域，與病毒抗原性和吸附入侵密切相關(guān)。S2區(qū)變異性小，在病毒與宿主細胞膜融合的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。

研究指出，目前不同PEDV毒株基因組的差異主要集中在S基因，特別是S1區(qū)域。在不同的 PEDV 毒株中，氨基酸的突變、插入、缺失現(xiàn)象均較為常見。通過對我國2014-2017年間各地報道的PEDV流行株的文獻進行梳理，發(fā)現(xiàn)近年來PEDV流行毒株S基因遺傳變異主要有以下特點：1）由表1可見，各地區(qū)分離的PEDV流行株在基因水平上與傳統(tǒng)的PEDV的CV777株同源性較低，均不高于95%，說明近年來PEDV毒株確實在基因水平上發(fā)生了變異；2）變異情況往往涵蓋基因缺失、插入和基因突變多種情況；3）突變區(qū)域主要分布在S1區(qū)；4）部分變異發(fā)生在PEDV毒株抗原保護位點，從而導(dǎo)致PEDV流行株免疫原性的改變；大部分變異為隨機發(fā)生，無規(guī)律可循，變異后所導(dǎo)致的毒株變化不得而知或處于研究狀態(tài)中。

2.2 M 蛋白

M蛋白是PEDV的囊膜糖蛋白，由226個氨基酸組成。編碼M蛋白的基因核苷酸序列具有高度的保守性。然而也有部分文獻指出，M基因也出現(xiàn)了一定的進化和變異的趨勢。這種趨勢主要表現(xiàn)為核苷酸序列上的基因突變。董波等對2015年1月-2017年6月期間采自閩西地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)豬場12份樣品分析發(fā)現(xiàn)，閩西毒株M基因與CV777 同源性為98． 7% 。此外，董波等指出在M基因上雖有11個基因位點發(fā)生突變，但是反應(yīng)在氨基酸水平上，其僅表現(xiàn)出3個氨基酸的改變。這些數(shù)據(jù)表明，不同PEDV毒株的M基因不論是在基因水平還是在氨基酸水平，仍然處于相對保守階段。2018年，丁衛(wèi)星等對收集的2株P(guān)EDV臨床毒株（D1和D3）的M基因進行克隆，分析后發(fā)現(xiàn)，與CV777相比，D1株存在12個核苷酸的插入，導(dǎo)致存在4個氨基酸的插入。這個發(fā)現(xiàn)與以往的基因突變形式是不一樣的?；虿迦胧欠駮蔀镸基因變異的新的形式還有待進一步的研究?？傮w而言，現(xiàn)階段M基因雖有突變，但仍是一個相對保守的基因。

圖1 PEDV結(jié)構(gòu)示意圖（畢靜，2013）

圖2 PEDV基因組結(jié)構(gòu)示意圖（王恩雨，2018）

2.3 E蛋白

E 蛋白是位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，由76個氨基酸組成。研究發(fā)現(xiàn)E基因在同群冠狀病毒中具有很高的同源性。

表1 近年來PEDV流行毒株S基因遺傳變異情況匯總

表2 我國PEDV疫苗株基因分群情況一覽表

2.4 N蛋白

N蛋白是核衣殼蛋白，由441個氨基酸構(gòu)成。Chen等對中國部分省的32個豬場當(dāng)前流行的 PEDV的N基因進行測序分析，結(jié)果顯示毒株之間同源性大于95．0%，和中國參考株同源性為95．6%～99．7 %，與致弱參考毒株CV777，DR13和83P-5 的核苷酸同源性為95．9 %～100．0% 。此外，所有的分析結(jié)果顯示，目前PEDV毒株之間N基因的變異為核苷酸的突變，不涉及核苷酸插入和缺失。這些研究結(jié)果表明N蛋白還是非常保守的。

3 我國疫苗株基因分群情況

自首個豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)滅活疫苗上市以來，目前，我國共有8個PEDV聯(lián)苗獲得了新獸藥證書，涉及PEDV疫苗毒株7個，分別為CV777株及其致弱毒株弱毒CV777株，AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R株，弱毒株ZJ08株，SCSZ-1株和LW/L株。

Wang Dong等于2016年對60株P(guān)EDV中國流行株和12株P(guān)EDV經(jīng)典株進行了全基因組進化樹分析，結(jié)果顯示，這些菌株可以劃分為兩個基因群：GI和GII。其中它們又可進一步劃分為GI-a、GI-b、GII-a和GII-b四個亞群。在這個分群體系中，經(jīng)典株集中在GI群，流行株主要集中在GII群中。對PEDV疫苗株基因群進行分析，結(jié)果顯示，CV777株及其致弱毒株弱毒CV777株作為經(jīng)典株，屬于GI-a亞群；ZJ08株屬于GI-b亞群；AJ1102株及其致弱毒株AJ1102-R株則屬于GII-b亞群。文中未對新近獲得新獸藥證書的疫苗株進行序列分析，相關(guān)文獻顯示，SCSZ-1株和LW/L株與經(jīng)典株CV777同源性較低，與流行株同源性可達98%以上。

4 流行株對PEDV防控的作用

PEDV作為一個含有大基因組的RNA病毒，與DNA病毒相比，其病毒基因組更容易發(fā)生重組和變異。從遺傳進化上而言，變異是病原微生物主動適應(yīng)環(huán)境和宿主的一種表現(xiàn)。當(dāng)其生存環(huán)境發(fā)生改變時，其必然進行自我改變以適應(yīng)新的生存環(huán)境。當(dāng)環(huán)境壓力增大，病原微生物不論是在變異的程度上，還是在變異的速度上都會有顯著地提升。這也就解釋了我國豬流行性腹瀉疫情以2010年為分水嶺、后期呈現(xiàn)暴發(fā)形勢的原因。

眾所周知，對于疫病防控而言，選用與導(dǎo)致該疫病發(fā)生的病原微生物進行免疫接種往往會獲得非常好的免疫保護作用。但是在現(xiàn)實情況下，完全依賴流行株對疫病進行防控是非常不可取也無法完全實現(xiàn)的。一方面，基因的變異是一種生物自發(fā)的行為，環(huán)境壓力不同導(dǎo)致的變異情況也就不同，從而出現(xiàn)同一時間段不同地區(qū)不同豬場的流行株存在差別。一味的套用變異株死/活疫苗，只會讓自己的豬場疫病情況更加復(fù)雜。另一方面，疫苗的研發(fā)是有滯后性的。目前雖然可以利用分子方法對流行株的基因組進行分析，但是無法對變異進行預(yù)測。而疫苗開發(fā)是需要時間的。一個新的疫苗從研發(fā)、生產(chǎn)到最終的上市需要大量的時間，而在這段時間中毒株的變異仍然在發(fā)生。因此人們永遠用不上由最新的流行株生產(chǎn)的疫苗。再次，毒株是疫苗不可或缺的一部分，但不是唯一的構(gòu)成。一種疫苗的好壞不僅與毒株有關(guān)，還與佐劑、生產(chǎn)工藝、疫苗質(zhì)量等因素息息相關(guān)。而對于疫苗的臨床使用效果而言，疫苗的使用方法、免疫程序、保存條件等因素更是至關(guān)重要的。

對于豬流行性腹瀉的防控而言，我們不僅要選擇適宜的疫苗，更要采用合適的免疫方式，結(jié)合最優(yōu)的免疫程序，做好環(huán)境和飼養(yǎng)的管理以及其他生物安全防護方面的措施。

（參考文獻略。如有需要，請與作者聯(lián)系。）