● 黃偉鋒 盧春敬 許光輝

食管癌主要有兩種類型，即鱗狀細(xì)胞癌和腺癌。在我國(guó)，90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，而國(guó)外腺癌占比較多，是消化系統(tǒng)常見的惡性實(shí)體瘤。它是我國(guó)癌癥死亡的第四大原因，也是世界十大癌癥之一[1]。

目前腫瘤化療存在的兩個(gè)主要問題是化療的副作用和多重耐藥性的發(fā)展，因此，最小化副作用和最大化功效已成為開發(fā)新的抗腫瘤藥物的主要目標(biāo)。中藥最近被認(rèn)為是開發(fā)抗癌藥物的新來源，并作為一種新的化療佐劑來提高療效或改善目前癌癥化療的副作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥的有效成分能在腫瘤細(xì)胞周期的某一階段發(fā)生作用，從而阻滯細(xì)胞增殖，或(和)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]，進(jìn)而發(fā)揮良好的抗腫瘤作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用。漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃酮，wogonin)是一種黃酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)多種腫瘤有抑制作用，包括多發(fā)性骨髓瘤[3]、肺腺癌[4]、膠質(zhì)瘤[5]、肝癌[6]、胃癌[7]、乳腺癌[8]等。其抗腫瘤分子機(jī)制包括：上調(diào)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，下調(diào)PI3K-AKT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)MAPKs，上調(diào)p53，抑制NF-κB信號(hào)通路，抑制GSK-3β活化以及ΔNp63的表達(dá)等[9]。本實(shí)驗(yàn)主要研究漢黃芩素抑制食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制，為漢黃芩素應(yīng)用于臨床抗腫瘤提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株KYSE150，購(gòu)自凱基生物(ATCC；Rockville，MD，USA)，培養(yǎng)于含有10%熱滅活胎牛血清(Gibco by Life Technologies，Carlsbad，CA，美國(guó))的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱條件控制為37°C，95%空氣/5%CO2，95%濕度。

1.2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)收集處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的KYSE150細(xì)胞，種植于96孔板中，每孔大約5×103細(xì)胞(為了減少液體蒸發(fā)，培養(yǎng)板周邊的孔用PBS填充)，培養(yǎng)箱培養(yǎng)3h使細(xì)胞貼壁。用不同濃度的漢黃芩素處理細(xì)胞(漢黃芩素溶解于DMSO，DMSO終濃度小于0.1%)，每個(gè)濃度的藥物設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，每孔加入20μL Cell Titer 96 AQ One Solution Reagent(Promega，Madison，WI，USA)，繼續(xù)培養(yǎng)2h。酶標(biāo)儀(MD SpectraMax M3，CA，USA)測(cè)量各孔的OD490nm和OD 650nm吸光值，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。

1.3細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)收集不同濃度漢黃芩素處理的KYSE150細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞，大約每組1×106個(gè)細(xì)胞。參考細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說明(Keygen Biotech，Nanjing，China)，將體積分?jǐn)?shù)為70%冷乙醇500μL加入到細(xì)胞中，固定細(xì)胞2小時(shí)至過夜，放置于4℃冰箱保存，染色前用PBS將固定液洗去，加入100μlRNase A 37℃水浴30min。最后加入400μL PI染色混勻，4℃避光 30 min，上機(jī)檢測(cè)，流式細(xì)胞儀記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光(BD Accuri C6，Ann Arbor，MI，USA)。用FlowJo software軟件分析細(xì)胞周期。

1.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)收集不同濃度漢黃芩素處理的KYSE150細(xì)胞和空白對(duì)照組細(xì)胞，大約每組1×106個(gè)細(xì)胞。參考細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Keygen Biotech，Nanjing，China)，加入5μL Annexin V-FITC 混合均勻后，加入5μL Propidium Iodide混勻，室溫、避光、令其反5～15min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488nm處的FL1和FL3。

2 結(jié)果

2.1漢黃芩素對(duì)KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)的影響細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，漢黃芩素處理KYSE150細(xì)胞48h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，且隨著藥物濃度的增大，其抑制生長(zhǎng)作用越大。漢黃芩素大于25μM的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，漢黃芩素10μM組的抑制作用與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表1)。漢黃芩素作用48h的IC50=(68.59±3.43)μM。

表1 漢黃芩素對(duì)KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

注：P值為加藥組與對(duì)照組(Control)相比

2.2漢黃芩素對(duì)KYSE150細(xì)胞周期的影響為了研究漢黃芩素抑制KYSE150細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，筆者進(jìn)行了細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明漢黃芩素作用于KYSE150細(xì)胞48h后，可以顯著抑制KYSE150細(xì)胞增殖，表現(xiàn)為細(xì)胞周期G0/G1期所占的比例顯著增加，而G2期細(xì)胞數(shù)顯著降低。另外，高濃度的漢黃芩素(100μM)能夠顯著增加亞G1期(凋亡細(xì)胞)的細(xì)胞比例(圖1、圖2)。

圖1 漢黃芩素作用48h后KYSE150細(xì)胞周期的變化

注：A：Control；B：50μM Wogonin；C：100μM Wogonin

圖2 漢黃芩素作用48h后KYSE150細(xì)胞周期的變化柱狀圖

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.3漢黃芩素對(duì)KYSE150細(xì)胞凋亡的影響在研究細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)高濃度的漢黃芩素可以增加亞G1期(凋亡細(xì)胞)的細(xì)胞比例，為了進(jìn)一步研究漢黃芩素對(duì)KYSE150細(xì)胞凋亡的影響，筆者利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行了細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，漢黃芩素干預(yù)48h后，漢黃芩素50、100μM組的細(xì)胞早期凋亡率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且漢黃芩素的濃度越高，細(xì)胞凋亡率也越高，有明顯的劑量依賴關(guān)系(圖3，圖4)。

圖3 漢黃芩素作用48h后KYSE150細(xì)胞凋亡分析

注：X軸代表AV-FITC染色，Y軸代表PI染色。LR和UR區(qū)域的百分比分別代表AV陽(yáng)性/PI陰性(早期凋亡)和AV陽(yáng)性/PI陽(yáng)性細(xì)胞(晚期凋亡)。A：Control；B：50μM Wogonin；C：100μM Wogonin

圖4 漢黃芩素作用48h后KYSE150細(xì)胞凋亡分析柱狀圖

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 討論

惡性腫瘤作為全球較大的疾病之一，嚴(yán)重危害人類的健康，是新世紀(jì)人類健康的第一殺手。當(dāng)今世界，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快、不良的生活方式以及環(huán)境的污染等問題，惡性腫瘤的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[10]。中藥學(xué)是我國(guó)醫(yī)藥事業(yè)的偉大傳承之一，漢黃芩素(5，7-二羥基-8-甲氧基黃烷酮)是從黃芩(唇形科)中提取的天然黃酮類化合物，在體外和體內(nèi)具有特別有效的抗腫瘤活性。有趣的是，漢黃芩素對(duì)正常細(xì)胞或組織沒有毒性或輕微毒性[11，12]。由于其對(duì)腫瘤細(xì)胞系的選擇性毒性，漢黃芩素成為一種有吸引力的候選藥物，是一種潛在的新型抗腫瘤藥物。

本次實(shí)驗(yàn)研究了中藥單體漢黃芩素對(duì)食管癌KYSE150細(xì)胞生存的影響，并對(duì)其可能的機(jī)制進(jìn)行初步探討。漢黃芩素對(duì)KYSE150細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并有劑量依賴性，與楊莉[13]對(duì)漢黃芩素抗腫瘤作用研究進(jìn)展的報(bào)告中關(guān)于漢黃芩素能呈劑量、時(shí)間依賴性地抑制細(xì)胞增殖的觀點(diǎn)相符合。細(xì)胞周期檢測(cè)表明，漢黃芩素能使KYSE150細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，從而表明干擾細(xì)胞周期進(jìn)程是漢黃芩素影響腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一。另外，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示，隨著漢黃芩素劑量的增大，凋亡細(xì)胞比例變大。蘆曦[7]等研究漢黃芩素對(duì)SGC7901細(xì)胞增殖和侵襲活性的影響，發(fā)現(xiàn)漢黃芩素對(duì)SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯抑制作用，其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50為(74.26±1.21)μM，與本實(shí)驗(yàn)得出的IC50=(68.59±3.43)μM相近。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明漢黃芩素作用48h后，影響腫瘤細(xì)胞周期分布，使S期、G2/M期細(xì)胞比例減少，G0/G1期細(xì)胞比例增大，表明漢黃芩素將腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。在個(gè)體發(fā)育過程中細(xì)胞的凋亡受基因調(diào)控，是一種細(xì)胞自殺活動(dòng)。惡性腫瘤的生物學(xué)特征包括細(xì)胞增殖過度、細(xì)胞凋亡受阻，研究表明漢黃芩素的抗腫瘤作用與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[9]。許多文獻(xiàn)表明，漢黃芩素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，例如Bcl-2、p53、survivin等[14]。

綜上所述，漢黃芩素能夠抑制食管癌SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這為漢黃芩素將來用于治療食管癌提供理論依據(jù)。