王 鑫 ，陳維忠 ，張 健 ，李景輝 ，孫元鵬 ，石云杰 ，張 雷 ，陳林麗 ，周 翔 ，周如華

（1．蘇州市公安局物證鑒定所，江蘇 蘇州 215131；2．無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，江蘇 無(wú)錫 214174）

20世紀(jì)90年代，短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat，STR）序列遺傳標(biāo)記開(kāi)始應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)的研究及鑒定[1]。STR基因座的復(fù)合擴(kuò)增技術(shù)以靈敏、準(zhǔn)確、快速、信息量大等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于個(gè)體識(shí)別和親子鑒定[2-3]。然而，在法醫(yī)物證學(xué)鑒定過(guò)程中，現(xiàn)場(chǎng)生物檢材的提取、保存及送檢容易受到環(huán)境影響，導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)降解、DNA含量降低以及抑制劑濃度增高，從而影響DNA檢驗(yàn)及分型[4-7]。如何對(duì)降解和微量的生物檢材進(jìn)行DNA檢驗(yàn)已成為法醫(yī)物證學(xué)檢驗(yàn)的一大難點(diǎn)。使用常規(guī)的熒光標(biāo)記STR試劑盒對(duì)降解和微量的生物檢材檢驗(yàn)，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)片段的STR基因座丟失或者檢驗(yàn)失敗。本研究擬采用miniSTR技術(shù)，即通過(guò)在STR基因座核心重復(fù)序列的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物，盡可能縮短復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物的片段，從而提高STR分型成功率[8-10]。

1 材料與方法

1.1 樣本

652份實(shí)際案件樣本（血跡112份，煙蒂135份，精斑30份，肋軟骨10份，脫落細(xì)胞365份），均來(lái)源于蘇州市公安局物證鑒定所；種屬特異性測(cè)試樣本——狗、豬、牛、羊、鼠、貓、兔和大腸桿菌購(gòu)于市場(chǎng)［豬、牛、羊購(gòu)于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)，鼠、兔血樣采集于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，狗、貓DNA采集寵物狗和寵物貓唾液樣本，大腸桿菌菌種購(gòu)買(mǎi)于生工生物工程（上海）股份有限公司］。

1.2 DNA提取和定量

DNA提取采用ReadyAmpTM基因組DNA提純系統(tǒng)（genomic DNA purification system，美國(guó) Promega公司）、磁珠DNA提取試劑盒（蘇州新海生物科技股份有限公司）和AGCU高效硅珠DNA提取純化試劑盒（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）提取，對(duì)使用磁珠和硅珠提取的DNA采用Qubit?3.0熒光定量?jī)x（美國(guó)Life Technologies公司）進(jìn)行定量。

1.3 復(fù)合PCR擴(kuò)增體系的建立

1.3.1 STR基因座選擇及miniSTR引物設(shè)計(jì)

本研究最終構(gòu)成的復(fù)合擴(kuò)增體系包含15個(gè)來(lái)自AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR 擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）的常染色體STR基因座，1個(gè)Y染色體基因座DYS391以及Amelogenin（表1）。使用Primer Premier 5.0和Oligo 7設(shè)計(jì)引物（表2），復(fù)合擴(kuò)增體系中的各引物滿足以下條件：引物堿基分布隨機(jī)、Tm值相近、GC含量在40%～60%、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列[11]。使用BLAST?（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 17個(gè)遺傳標(biāo)記的相關(guān)信息

表2 17個(gè)基因座的引物信息及濃度

續(xù)表2

1.3.2 PCR擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系包含：PCR擴(kuò)增緩沖液Master Mix（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）10μL，六色mini引物 5μL，基因組 DNA 0.1～2.0ng，純水補(bǔ)至 25μL。擴(kuò)增使用9700型PCR儀（美國(guó)AB公司），根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)推薦的循環(huán)條件：95℃ 5min；94℃ 15s，59℃ 50s，65℃ 30s，循環(huán) 29次；60℃ 7min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。

1.3.3 電泳及STR分型

1 μL的PCR產(chǎn)物與0.5 μL內(nèi)標(biāo)（無(wú)錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司，Marker SIZ-500，SIZ熒光標(biāo)記）和10μL去離子甲酰胺（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）混合，95℃變性3min后冰浴，電泳檢測(cè)。使用3500xL基因分析儀（美國(guó)AB公司）以1.2kV 24s進(jìn)行電泳分離，使用GeneMapper?ID-X 1.4軟件（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.4 等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備

使用熒光標(biāo)記引物擴(kuò)增不同檢材，收集17個(gè)基因座上不同等位基因的樣本。使用非熒光標(biāo)記引物對(duì)收集到的樣本進(jìn)行單基因座擴(kuò)增，并使用分子克隆技術(shù)和堿裂解法制備17個(gè)基因座的不同等位基因質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，使用每個(gè)基因座對(duì)應(yīng)的熒光標(biāo)記引物分別使用9700型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并混合擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)組合調(diào)平，最終制成等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物。

1.4 擴(kuò)增體系技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證

1.4.1 分型一致、種屬特異性及穩(wěn)定性驗(yàn)證

652份案件樣本按本研究方法進(jìn)行擴(kuò)增與分型檢測(cè)，其中常染色體基因座分型結(jié)果與AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒分型結(jié)果進(jìn)行比較，DYS391分型結(jié)果與YfilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）分型結(jié)果進(jìn)行比較。

種屬特異性驗(yàn)證分別采用狗、豬、牛、羊、鼠、貓、兔和大腸桿菌等生物檢材，提取DNA后使用上述復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)，檢測(cè)是否出現(xiàn)特異的DNA分型。

將試劑盒中的試劑PCR擴(kuò)增緩沖液、六色mini引物、等位基因ladder和內(nèi)標(biāo)SIZ-500進(jìn)行反復(fù)凍融和復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，凍融次數(shù)分別為10、15、20次。

1.4.2 靈敏度、混合樣本、抗抑制能力及擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)驗(yàn)證

靈敏度驗(yàn)證選用DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948（美國(guó)Promega公司），根據(jù)濃度進(jìn)行倍比稀釋，取總模板量分別為500、250、125、50、30 pg 的DNA 標(biāo)準(zhǔn)品 9948 進(jìn)行平行重復(fù)檢測(cè)3次。

混合樣本制備選用DNA標(biāo)準(zhǔn)品9947A（美國(guó)Promega公司）和9948，根據(jù)定量結(jié)果及濃度分別按19∶1、9∶1、5∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶5、1∶9、1∶19 的比例混合，模板總量為1ng，平行重復(fù)檢測(cè)3次。

抑制劑包括血紅素（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、血紅蛋白（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）、靛藍(lán)（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、腐殖酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA，美國(guó) Sigma-Aldrich 公司）與鈣離子（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。在含有0.5 ng DNA標(biāo)準(zhǔn)品 9948的 25 μL體系中，加入終濃度為 75～150 μmol/L 血紅素、20～50 μmol/L 血紅蛋白、14～20 mmol/L 靛藍(lán)、100～175 ng/μL 腐殖酸、800～1600μmol/L EDTA與1～2.5mmol/L鈣離子作為抑制劑，進(jìn)行PCR產(chǎn)物檢測(cè)，考察試劑盒對(duì)不同濃度抑制劑的耐受能力。

根據(jù)《法庭科學(xué)人類熒光標(biāo)記STR復(fù)合擴(kuò)增檢測(cè)試劑質(zhì)量基本要求》（GA/T 815—2009）選用125pg的DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948，按照上述復(fù)合擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)，擴(kuò)增條件中循環(huán)次數(shù)分別選擇26、28、29、30、32，并且平行重復(fù)檢測(cè) 3 次。

1.4.3 stutter比例驗(yàn)證

對(duì)652份案件樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)六色熒光標(biāo)記 miniSTR系統(tǒng)和AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒每個(gè)基因座的stutter峰高比例，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）。

1.4.4 DNA提取方法與案件檢材適應(yīng)性驗(yàn)證

對(duì)652份樣本外的60份血跡、64份煙蒂、30份精斑、10份肋軟骨、80份接觸性棉簽擦拭子采用不同方法提取DNA并定量，進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。

分別采用Chelex-100法、磁珠法、硅珠法提取樣本DNA進(jìn)行上述復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，根據(jù)分型結(jié)果比較不同提取方法對(duì)分型結(jié)果的影響。

1.4.5 降解檢材檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證

取實(shí)驗(yàn)室陳舊降解血液樣本1份（AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒檢測(cè)分型不完整）使用磁珠法提取DNA、DNaseⅠ（日本TaKaRa公司）處理標(biāo)準(zhǔn)品1份（1 ng標(biāo)準(zhǔn)品9948中加入0.1 U DNaseⅠ酶，15℃反應(yīng)2 h），使用該六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 分型一致、種屬特異性及穩(wěn)定性驗(yàn)證

652份實(shí)際案件樣本的DNA提取產(chǎn)物，使用本次研究的六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)、AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒和YfilerTMPlus PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行平行檢驗(yàn)，有效DNA檢驗(yàn)STR分型結(jié)果一致。

對(duì)狗、豬、牛、羊、鼠、貓、兔和大腸桿菌等生物檢材的DNA進(jìn)行檢測(cè)，在分型范圍內(nèi)，均沒(méi)有出現(xiàn)特異的DNA分型。

對(duì)六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)中的主要組分進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試，試劑經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融和復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)品9948檢測(cè)，結(jié)果顯示，STR分型完整，圖譜分布均衡。反復(fù)凍融20次仍能獲得完整的STR分型。

2.2 靈敏度、混合樣本、抗抑制能力及擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)驗(yàn)證

取總模板量 500、250、125、50、30 pg 的 DNA 標(biāo)準(zhǔn)品9948，使用本研究的復(fù)合擴(kuò)增試劑進(jìn)行檢驗(yàn)，擴(kuò)增條件中的循環(huán)次數(shù)分別為29和30次循環(huán)，根據(jù)分型結(jié)果統(tǒng)計(jì)基因座的檢出率。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總模板量為30pg的DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948，循環(huán)29次，漏檢4個(gè)基因座，循環(huán)30次，漏檢2個(gè)基因座。而總模板量為50pg及以上的DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948均能獲得完整STR分型。因此，本研究的六色miniSTR的檢測(cè)靈敏度為50pg DNA。

混合樣本DNA檢驗(yàn)結(jié)果顯示，分型分布與兩者在混合物中的濃度比例相關(guān)（圖1）?；旌衔餄舛缺壤嘟ㄔ?∶1和1∶5之間），兩者的STR分型分布均衡，90%以上的次要基因座能夠得到有效分型。隨著混合物比例差異的增加，次要成分的STR分型分布出現(xiàn)下降，當(dāng)混合物濃度比例達(dá)到19∶1和1∶19時(shí)，濃度低的樣本STR基因座分布僅約53%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品9947A與9948不同混合比例下的次要成分基因座平均檢出率

當(dāng)血紅素濃度不大于125μmol/L，各基因座均可獲得有效擴(kuò)增；血紅蛋白在40 μmol/L以內(nèi)，對(duì)試劑盒擴(kuò)增沒(méi)有影響；靛藍(lán)濃度在16 mmol/L以內(nèi)，對(duì)試劑盒擴(kuò)增沒(méi)有影響；腐殖酸濃度不高于150 ng/μL時(shí)，各基因座均可獲得有效擴(kuò)增；EDTA濃度不高于1200μmol/L時(shí)，各基因座均可有效擴(kuò)增；鈣離子濃度不高于2mmol/L時(shí)，各基因座均可有效擴(kuò)增。

125pg的DNA標(biāo)準(zhǔn)品9948的STR分型的熒光信號(hào)與擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)成正相關(guān)。當(dāng)循環(huán)28次以上時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品9948的STR分型完整，分布均勻，產(chǎn)物擴(kuò)增峰值隨著擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)增加，位于500～30 000 RFU，但是循環(huán)32次的擴(kuò)增信號(hào)過(guò)強(qiáng)，出現(xiàn)熒光滲透峰。當(dāng)循環(huán)26次，標(biāo)準(zhǔn)品9948的STR分型結(jié)果出現(xiàn)部分基因座的丟失，因此，根據(jù)反復(fù)的復(fù)合擴(kuò)增測(cè)試，推薦使用循環(huán)29次進(jìn)行案件樣本的檢測(cè)。若樣本濃度高于500pg可以相應(yīng)減少循環(huán)數(shù)，反之亦然，但不要超過(guò)31個(gè)循環(huán)，避免加重PCR的隨機(jī)擴(kuò)增效應(yīng)。

2.3 stutter峰高比例驗(yàn)證

采用六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)及AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒平行擴(kuò)增652份案件樣本，并對(duì)stutter峰高比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩個(gè)試劑盒中每個(gè)基因座的stutter峰高比例平均百分比均在12%以下，且stutter峰高比例高或低的基因座，在兩個(gè)試劑盒間不存在明顯差異性（表3）。

表3 各基因座stutter峰高比例平均百分比 （n=652）

2.4 實(shí)際案件樣本檢測(cè)與檢材適應(yīng)性驗(yàn)證

本研究中的常規(guī)檢材（血跡、煙蒂、精斑、肋軟骨）檢出率，采用六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)和AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒均為93.73%（269/287），脫落細(xì)胞的檢出率采用六色熒光標(biāo)記 miniSTR系統(tǒng)和 AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒分別為26.03%（95/365）和25.75%（94/365）。選取另外60份血跡樣本、64份煙蒂樣本、30份精斑、10份肋軟骨、80份接觸性棉簽擦拭子分別使用3種DNA提取方法（Chelex-100法、磁珠法、硅珠法）進(jìn)行DNA提取及六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)復(fù)合擴(kuò)增檢驗(yàn)，STR分型結(jié)果完整，峰值分布均衡。

2.5 降解檢材檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證

實(shí)驗(yàn)室陳舊降解血液樣本和DNaseⅠ處理的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)六色熒光標(biāo)記miniSTR系統(tǒng)檢測(cè)，均獲得完整分型。

3 討 論

商業(yè)化STR試劑盒在擴(kuò)增降解、含高抑制劑的樣本時(shí)，大片段擴(kuò)增效率會(huì)明顯下降甚至丟失，縮短擴(kuò)增片段長(zhǎng)度可以提高降解檢材和含高抑制劑檢材的檢出率。本研究的檢測(cè)系統(tǒng)在靠近STR基因座核心重復(fù)區(qū)設(shè)計(jì)引物減小擴(kuò)增子片段長(zhǎng)度，將15個(gè)常染色體STR基因座、1個(gè)Amelogenin基因座和1個(gè)DYS391基因座合理排布于300bp（包含了FGA國(guó)外人群稀有等位基因42.2～50.2，最長(zhǎng)的50.2可達(dá)307.8bp以內(nèi)。引物設(shè)計(jì)時(shí)，避免由于引物3′端序列同源性較高而導(dǎo)致錯(cuò)誤。同時(shí)考慮引物在不同檢材擴(kuò)增的適用性，保證不同檢材擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增效率都要滿足試劑盒均衡性要求。通過(guò)對(duì)陳舊降解樣本和DNaseⅠ處理標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，六色熒光標(biāo)記的16個(gè)miniSTR可以有效獲得完整分型，適用于降解樣本檢測(cè)。與AmpF?STR?miniFilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)AB公司）不同，本檢測(cè)系統(tǒng)的miniSTR基因座包含AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒全部的基因座，與數(shù)據(jù)庫(kù)兼容性高，且擴(kuò)增子小于300bp。另外，在檢測(cè)系統(tǒng)中新增DYS391基因座，可以在Y等位基因缺失的情況下輔助提供性別信息。針對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制劑，篩選高性能的PCR緩沖系統(tǒng)，優(yōu)化熱循環(huán)參數(shù)，顯著提高了體系擴(kuò)增性能。本研究采用新型的能量轉(zhuǎn)移染料、優(yōu)化的PCR緩沖體系、以miniSTR理念設(shè)計(jì)的更小的擴(kuò)增子，改善了在降解、微量樣本中容易出現(xiàn)大片段丟失的情況。同時(shí)，合理的位點(diǎn)排布也避免了類似的miniSTR檢測(cè)系統(tǒng)（如AmpF?STR?miniFilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒）僅作為補(bǔ)充試劑盒的作用，本系統(tǒng)可以應(yīng)用于案件現(xiàn)場(chǎng)樣本檢測(cè)和建庫(kù)樣本檢測(cè)。經(jīng)過(guò)性能評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，六色熒光標(biāo)記的16個(gè)miniSTR試劑盒具有較高的檢測(cè)靈敏度、抗抑制劑能力強(qiáng)、特異性好、擴(kuò)增系統(tǒng)試劑組分穩(wěn)定，適用于混合樣本等特殊檢材的DNA檢驗(yàn)分型。對(duì)實(shí)際案件樣本的檢出率達(dá)到甚至超過(guò) AmpF?STR?Identifiler?Plus PCR擴(kuò)增試劑盒的水平，可用于實(shí)際案件檢驗(yàn)，為法庭科學(xué)DNA分析提供一種新方法。