郭俊紅 武春燕 董正偉 吳偉 張莉萍 李輝 黃焰

結(jié)核病是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，據(jù)2017年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的全球結(jié)核病年度報(bào)告顯示，全球每年有超過(guò)1000萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，同時(shí)有近170萬(wàn)例患者死于結(jié)核病[1]。受到疾病臨床分期、抗生素大量使用等多種因素影響，痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)等的檢測(cè)陽(yáng)性率較低，結(jié)核病診斷困難。近年來(lái)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌成為診斷結(jié)核病的有效手段[2]，而肺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)(fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC)病理檢測(cè)因其簡(jiǎn)單快捷、微創(chuàng)安全而被廣泛應(yīng)用于臨床取樣，可幫助診斷肺部疾病[3-4]。目前兩者聯(lián)合檢測(cè)的研究較多，但主要集中在對(duì)肺外結(jié)核的診斷[5-7]，對(duì)肺結(jié)核診斷效能的研究還較少。本研究采用 CT引導(dǎo)下肺細(xì)針穿刺活檢標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)，以探討兩者聯(lián)合在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

一、 研究對(duì)象

1.一般資料：回顧性選取2017年1月至2018年3月同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院曾疑診為肺結(jié)核、后經(jīng)病理證實(shí)或試驗(yàn)性抗結(jié)核藥物治療確診的111例患者，其中肺結(jié)核患者73例(65.8%)，非肺結(jié)核患者38例(34.2%；包括結(jié)節(jié)病3例、肺癌17例、隱球菌感染3例、曲菌感染4例、肺膿腫3例、異物肉芽腫2例，支氣管擴(kuò)張癥6例)。111例患者均在CT引導(dǎo)下獲取肺穿刺活檢標(biāo)本行涂片細(xì)胞病理學(xué)檢查(簡(jiǎn)稱“細(xì)胞病理學(xué)檢查”)，其中13例因兩次細(xì)胞病理學(xué)檢查不能確診而行CT引導(dǎo)下粗針?lè)未┐袒顧z標(biāo)本組織病理學(xué)檢查(簡(jiǎn)稱“組織病理學(xué)檢查”)；上述標(biāo)本均同時(shí)采用PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌DNA(分別簡(jiǎn)稱為“細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)”與“組織病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)”)。

111例患者中，男71例(64.0%)，女40例(36.0%)；年齡16～79歲，平均(49.9±17.8)歲；臨床表現(xiàn)為反復(fù)咳嗽、咳痰，伴或不伴消瘦、盜汗、胸痛、胸腔積液等癥狀。73例(65.8%)肺結(jié)核患者中，男48例(65.8%)，女25例(34.2%)；年齡16～79歲，平均(45.2±19.0)歲。以臨床最終診斷為標(biāo)準(zhǔn)，探究細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)診斷肺結(jié)核的檢測(cè)效能(敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、正確指數(shù))，以及組織病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)的檢出效用。

2.診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)肺結(jié)核：根據(jù)新版《WS 288—2017肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)》[8]入組，包括①臨床診斷肺結(jié)核：依據(jù)患者的結(jié)核病病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室相關(guān)檢查、肺外組織病理及診斷性抗結(jié)核治療效果診斷；②確診患者：依據(jù)痰涂片、痰培養(yǎng)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)檢查診斷。(2)非結(jié)核肺部疾?。簩?duì)結(jié)核病相關(guān)檢查陰性或存在懷疑體征時(shí)，通過(guò)再次穿刺、組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)檢查，根據(jù)病理學(xué)及臨床檢測(cè)明確診斷的其他疾病，如肺癌、結(jié)節(jié)病、真菌感染等。

3.病理診斷：對(duì)首次細(xì)胞病理診斷可疑者再次行細(xì)胞病理學(xué)檢查，若兩次均不能確診則穿刺或手術(shù)后取組織樣本行組織病理學(xué)檢查。

二、穿刺細(xì)胞病理學(xué)檢查及細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)

1.穿刺及細(xì)胞學(xué)制片：由臨床醫(yī)生行CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺，于CT定位點(diǎn)處常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，持22 G×0.7 mm穿刺針穿刺，立即涂片1張投入95%乙醇固定15 min后采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)。針管內(nèi)剩余材料打入液基瓶保存。充分振蕩混勻細(xì)胞，去除血凝塊、組織碎塊后，放入離心機(jī)890×g離心10 min，棄上清留取沉淀，加入30 ml 液基細(xì)胞保存液(CytoRichTM)紅色固定液，振蕩后靜置30 min，890×g離心10 min，倒掉上清并充分振蕩，吸取1～5滴轉(zhuǎn)移至12 ml離心管內(nèi)，加入10 ml緩沖液，890×g離心5 min，倒上清并振蕩，在玻片架上與離心管對(duì)應(yīng)的位置上放SurePathTMPreCoat玻片，將吸液管與對(duì)應(yīng)的試劑瓶正確連接，運(yùn)行制片程序。

2.鏡下表現(xiàn)：根據(jù)Bezabih等[9]的研究分型：(1)增殖型：可見(jiàn)類上皮細(xì)胞，包括郎罕細(xì)胞及組織細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(增殖性肉芽腫)。(2)干酪樣壞死型：可見(jiàn)壞死組織伴或不伴有炎癥背景。(3)混合型：干酪樣壞死型伴有增殖型。

3.判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞病理學(xué)檢查診斷結(jié)核病的主要依據(jù)是切片中找到干酪樣壞死物、郎罕細(xì)胞和類上皮細(xì)胞，若三者同時(shí)見(jiàn)于細(xì)胞學(xué)切片可診斷結(jié)核病，若只出現(xiàn)1種或2種則為可疑結(jié)核病[10]。

4. 細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)：(1)DNA的提?。簩⒓?xì)胞病理學(xué)標(biāo)本離心，棄上清留取沉淀，具體操作步驟嚴(yán)格按照核酸提取DNA說(shuō)明書(shū)(廈門(mén)艾德生物有限公司)進(jìn)行。(2)Stratagene Mx 3000P型熒光定量PCR儀擴(kuò)增：按照結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?說(shuō)明書(shū)(北京鑫諾美迪基因檢測(cè)技術(shù)有限公司)進(jìn)行。

三、組織病理學(xué)檢查與組織病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR 檢測(cè)

1.組織病理學(xué)檢查：由臨床醫(yī)生行CT引導(dǎo)下經(jīng)皮肺穿刺，于CT定位點(diǎn)處常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，持18 G×1.2 mm活檢穿刺針穿刺。將穿刺標(biāo)本放入10%甲醛固定液內(nèi)送病理檢查，經(jīng)脫水、包埋、切片及HE染色制片。

2.病理診斷：組織病理學(xué)診斷結(jié)核病的依據(jù)：特征性病理學(xué)形態(tài)特點(diǎn)(壞死性肉芽腫性病變)及抗酸染色結(jié)果陽(yáng)性。

3. 組織病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)：將組織病理學(xué)標(biāo)本進(jìn)一步切成蠟卷，脫蠟后進(jìn)行DNA提取，所有操作、儀器、制劑的使用均同細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR 檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、一致性評(píng)價(jià)細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)診斷肺結(jié)核的檢測(cè)效能。相關(guān)公式：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；正確指數(shù)(或一致性)=敏感度+特異度-1。

結(jié) 果

一、細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)效能

細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)對(duì)肺結(jié)核的檢測(cè)敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、正確指數(shù)分別為83.6%(61/73)、89.5%(34/38)、93.8%(61/65)、73.9%(34/46)、0.73；單一細(xì)胞病理學(xué)檢查肺結(jié)核的檢測(cè)敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、正確指數(shù)分別為39.7%(29/73)、94.7%(36/38)、93.5%(29/31)、45.0%(36/80)、0.34，見(jiàn)表1。前者對(duì)肺結(jié)核檢測(cè)的陽(yáng)性率(83.6%)明顯高于后者(39.7%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.663，P=0.000)。

二、細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本與組織病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR 檢測(cè)結(jié)果的比較

13例肺結(jié)核患者組織病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性者8例；而細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)陽(yáng)性者為12例。另外，73例肺結(jié)核患者中有9例經(jīng)穿刺活檢細(xì)胞病理學(xué)、組織病理學(xué)檢查均未能診斷出肺結(jié)核，同時(shí)傳統(tǒng)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及熒光抗酸染色檢查等亦均陰性，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)后有4例為陽(yáng)性。此外，本研究有4例患者細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR 檢測(cè)陽(yáng)性，經(jīng)再次穿刺細(xì)胞病理學(xué)檢查診斷為小細(xì)胞癌1例、腺癌2例；經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷肺曲菌球病1例。

三、肺結(jié)核不同細(xì)胞學(xué)分型患者行TB-PCR檢測(cè)結(jié)果分析

臨床最終診斷為肺結(jié)核的73例患者中，鏡下表現(xiàn)為增殖型9例，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)陽(yáng)性3例(3/9)；干酪樣壞死型35例，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)陽(yáng)性32例(32/35)；混合型29例，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)陽(yáng)性26例(26/29)。

討 論

肺結(jié)核至今仍然是嚴(yán)重威脅全球人民健康的呼吸道傳染性疾病，近年來(lái)結(jié)核病患者例數(shù)呈上升趨勢(shì)[1,11-12]，但受患者疾病臨床分期、抗生素大量使用等多種因素影響，細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽(yáng)性率較低，且診斷周期為4～6周，很難滿足為患者及時(shí)制定治療方案的臨床需求[13]。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病與諾卡菌感染在細(xì)胞病理學(xué)檢查中形態(tài)學(xué)都可見(jiàn)多核巨細(xì)胞及壞死，且諾卡菌抗酸染色亦可呈陽(yáng)性，但諾卡菌對(duì)長(zhǎng)周期抗生素治療有效，因此準(zhǔn)確的診斷是至關(guān)重要的，需要進(jìn)行分子病理檢測(cè)或培養(yǎng)加以鑒別[14]。為提高我國(guó)肺結(jié)核診斷水平，國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)[8]重新發(fā)布了新版《WS 288—2017肺結(jié)核診斷》，在細(xì)菌學(xué)檢查的基礎(chǔ)上，新增了分子生物學(xué)檢查，強(qiáng)調(diào)可以以病原學(xué)、病理學(xué)結(jié)果作為確診依據(jù)。

表1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)與細(xì)胞病理學(xué)檢查的效能

注敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；正確指數(shù)(或一致性)=敏感度+特異度-1

細(xì)胞病理學(xué)檢查具有易于操作、技術(shù)安全、診斷迅速、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn)[15]，我院開(kāi)展細(xì)胞病理學(xué)檢查10余年，有豐富的細(xì)胞病理學(xué)診斷經(jīng)驗(yàn)，如采用細(xì)胞病理學(xué)檢查有明確相關(guān)疾病(包括惡性腫瘤、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、其他良性疾病等)的病理學(xué)診斷，臨床可以根據(jù)該結(jié)果(陽(yáng)性)為確診依據(jù)制定治療方案；若細(xì)胞病理學(xué)檢查不能明確(陰性)診斷，如未見(jiàn)惡性病變依據(jù)或只見(jiàn)肉芽腫病變無(wú)法區(qū)分結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、真菌感染等，則同期進(jìn)行經(jīng)皮肺穿刺、縱隔鏡、胸腔鏡及開(kāi)胸取活檢組織病理學(xué)檢測(cè)為最終診斷依據(jù)[15]。細(xì)胞學(xué)病理標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)有著較高的敏感度(56%)、特異度(100%)[16]，可將結(jié)核分枝桿菌染色體特異的極微量的DNA擴(kuò)增百倍以上。本研究對(duì)肺結(jié)核細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率[83.6%(61/73)]明顯高于單一細(xì)胞病理學(xué)檢測(cè)肺結(jié)核的陽(yáng)性率[39.7%(29/73)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.663，P=0.000)。提示在細(xì)胞病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上增加TB-PCR檢測(cè)可提高肺結(jié)核檢測(cè)的陽(yáng)性率，病理學(xué)檢查醫(yī)生在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)可疑結(jié)核病證據(jù)后，立即行細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR 檢測(cè)，可極大地縮短診斷時(shí)間，為臨床治療提供方便。

細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)可能使部分結(jié)核病患者在組織學(xué)活檢和病原學(xué)均陰性的情況下減少進(jìn)一步的組織學(xué)檢查[16]。本研究對(duì)13例肺結(jié)核患者組織病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性者8例；而細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)陽(yáng)性者為12例，高于前者。表明細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性檢出例數(shù)優(yōu)于前者，有利于降低臨床穿刺風(fēng)險(xiǎn)及減少術(shù)后并發(fā)癥。但是由于樣本量小，檢驗(yàn)結(jié)果可能存在偏倚，今后需進(jìn)一步收集更多樣本加以驗(yàn)證。此外，本次研究肺結(jié)核患者中有9例經(jīng)穿刺活檢組織病理學(xué)檢查未獲得診斷依據(jù)，同時(shí)傳統(tǒng)技術(shù)(痰涂片抗酸染色及痰培養(yǎng))檢測(cè)結(jié)果亦陰性，其中4例經(jīng)細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性，進(jìn)一步提示細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)可減少進(jìn)一步的組織病理學(xué)檢查。

結(jié)核病常見(jiàn)的組織病理學(xué)改變?yōu)閴乃佬匀庋磕[性炎，但亦可為非壞死性肉芽腫性炎，亦可見(jiàn)缺少肉芽腫病變的干酪樣壞死結(jié)節(jié)，典型的結(jié)核結(jié)節(jié)中心為干酪樣壞死，周邊可見(jiàn)類上皮細(xì)胞和(或)郎罕細(xì)胞，外周有纖維結(jié)締組織和慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)。本研究鏡下細(xì)胞病理學(xué)與組織病理學(xué)形態(tài)相符，病變內(nèi)可見(jiàn)類上皮細(xì)胞、干酪樣壞死及郎罕細(xì)胞[17]。本研究根據(jù)細(xì)胞學(xué)形態(tài)分為增殖型、混合型及干酪樣壞死型[9]。本研究73例肺結(jié)核患者中，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)出陽(yáng)性患者干酪樣壞死型(32例，32/35)及混合型(26例，26/29)的比例高于增殖型(3例，3/9)，可能與增殖期荷菌量少、毒力低，而此時(shí)人體免疫力還較強(qiáng)，結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核結(jié)節(jié)形成過(guò)程中被及時(shí)清除有關(guān)。本研究仍有12例患者細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)陰性，可能與部分患者(7例)正在或既往進(jìn)行過(guò)抗結(jié)核藥物治療有關(guān)；導(dǎo)致病灶標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌菌量少而難以檢出，另外，穿刺活檢組織位于壞死中心或穿刺時(shí)引起出血等均可明顯干擾結(jié)核分枝桿菌DNA的提取。

研究表明，肺結(jié)核并發(fā)肺癌的發(fā)生率為0.22%～2.7%，并且呈逐年增加的趨勢(shì)[18]，抗結(jié)核和抗腫瘤雙重治療可改善患者預(yù)后[19-20]。對(duì)于肺癌并發(fā)肺結(jié)核的患者，兩病具有相似的臨床癥狀和影像學(xué)特征，易被誤診、漏診而影響治療時(shí)機(jī)[21]。曲球菌常寄生于許多肺部病變構(gòu)成的空洞或空腔中，如肺結(jié)核空洞、慢性肺膿腫、肺癌等[22]，也常為肺結(jié)核的并發(fā)疾病。本研究有4例細(xì)胞學(xué)病理標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)陽(yáng)性，經(jīng)再次穿刺細(xì)胞病理學(xué)檢查診斷為小細(xì)胞癌1例、腺癌2例；經(jīng)組織病理學(xué)檢查診斷曲菌球1例。因穿刺活檢標(biāo)本行細(xì)胞學(xué)檢查及組織學(xué)檢查時(shí)穿刺部位較局限，不能排除存在肺結(jié)核并發(fā)肺癌、曲菌球感染的情況，但在可能存在并發(fā)疾病的情況下及時(shí)發(fā)現(xiàn)及治療肺結(jié)核非常必要，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本及組織病理學(xué)標(biāo)本行TB-PCR檢測(cè)可簡(jiǎn)便、快速地幫助診斷肺結(jié)核。

綜上所述，細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)是診斷肺結(jié)核的有效手段，在細(xì)胞病理學(xué)檢查的基礎(chǔ)上增加細(xì)胞病理學(xué)標(biāo)本TB-PCR檢測(cè)可提高肺結(jié)核檢測(cè)的陽(yáng)性率，在肺結(jié)核的病理診斷中具有良好的應(yīng)用價(jià)值。