王繁，邱海凡，劉奕，陳璐璐，范風云，王宗敏

（溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.產科；2.病理科）

鎘（Cadmium，Cd）是一種普遍存在的重金屬環(huán)境毒物。隨著工業(yè)化的進展，更多的人暴露于鎘污染下[1]。鎘對腎臟、心血管系統(tǒng)等多種器官產生不良影響，生殖系統(tǒng)被認為是鎘毒性作用最敏感的靶器官之一。妊娠狀態(tài)下由于部分微量元素相對缺乏，使腸道對鎘的吸收明顯增加，而導致孕婦體內鎘蓄積較非妊娠時高[2]，而且妊娠期間母體和胎兒因生長迅速和細胞分化而易受環(huán)境毒物的影響。鎘是否因而可以誘發(fā)孕鼠的妊娠高血壓疾病未見報道。本研究觀察不同濃度鎘劑量對孕期大鼠的血壓、蛋白尿等妊娠高血壓疾病臨床癥狀的影響以及胎盤、肝、腎等臟器病理改變，探討鎘對孕鼠的生殖毒性效應及特點。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物為普通級別SD大鼠，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物研究所，其中雌鼠10～12周齡，體質量200～240 g；雄鼠12周齡左右，體質量300～350 g。所有的動物實驗都遵守國際和國家相關準則，實驗動物的使用獲得同濟醫(yī)學院實驗動物委員會批準。在實驗開始前讓大鼠適應性飼養(yǎng)1周。實驗用氯化鎘購自上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組和不同劑量染鎘實驗：將確定妊娠的成年雌性SD大鼠隨機排序分為3組，對照組[n=6，體質量（204.5±5.9）g]，0.25 mg/kg鎘處理組[n=7，體質量（210.0±5.1）g]，0.5 mg/kg鎘處理組[n=8，體質量（211.8±11.3）g]。鎘處理組從妊娠第4天開始至妊娠第19天，每天上午給予孕鼠腹腔注射2 mL/kg相應濃度的鎘。對照組腹腔注射2 mL/kg 0.9%氯化鈉溶液。非孕組（n=6）在相同的時間以0.5 mg/kg的劑量腹腔注射鎘做對照。整個實驗期監(jiān)測大鼠體質量，最后得到的氯化鎘最低劑量與最佳時間誘導大鼠妊娠高血壓疾病模型。

1.2.2 血壓測量：分別在交配前1周，以及妊娠的第4、第12、第19天上午9～11時，使用softron BP-98A型無創(chuàng)血壓計，用尾套法檢測各組孕鼠尾動脈的收縮壓，并以交配前最穩(wěn)定的血壓值作為每只大鼠的基礎血壓值。大鼠充分安靜后連續(xù)測量5次，取平均值。計算并比較各組妊娠第4、第12、第19天與基礎血壓的差值。非孕大鼠則在相應的測量時間檢測收縮壓。

1.2.3 24 h尿蛋白量測定：在妊娠期的第3天和第19天，將孕鼠放置于代謝籠中，收集其24 h尿液標本并記錄尿量，于室溫下2 000 r/min離心15 min，吸取其上清液，測量體積后保存于-80 ℃冰箱待檢測。采用BCA蛋白試劑盒檢測尿液標本中尿蛋白的濃度，按照BCA蛋白分析試劑盒說明書用A液和B液配制成工作液和標準液，然后用酶標儀在562 nm測量OD值。在Excel表中根據標準曲線計算出孔的待測蛋白濃度，再乘以尿液的量，即為24 h尿蛋白量。計算并比較各組妊娠第3天與第19天尿蛋白的差值。

1.2.4 標本收集：妊娠第20天麻醉大鼠后斷頭術處死大鼠打開腹腔，計胎仔數，觀察肝、腎等臟器有無變化，迅速取出胎兒、胎盤、腎臟和腦組織并稱重。每只大鼠隨機選取3個胎盤、1個腎臟、肝臟、腦組織固定于10%的甲醛溶液，常規(guī)制片染色作組織學檢查。另取胎盤在0～4 ℃條件下迅速將組織切成1 mm3大小的組織塊，用2.5%的戊二醛固定，再放入用相同緩沖液配制的1%鋨酸中，于4 ℃固定2 h。然后常規(guī)超薄切片，電鏡觀察細胞超微結構。并另取胎盤及母鼠血，通過石墨爐原子吸收法測其鎘含量。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析。各組數據以表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血和胎盤中鎘的濃度 0.5 mg/kg鎘處理組的孕鼠胎盤鎘的水平[（2.81±0.51）μg/g]明顯高于0.25 mg/kg鎘處理組[（1.03±0.30）μg/g]，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠血中也檢測到（30.6±0.2）μg/L濃度的鎘。

2.2 孕鼠體質量變化的比較 鎘染毒前，即妊娠第1天至第4天，各組孕鼠體質量無明顯差別。孕期0.5 mg/kg鎘處理組體質量增長最小，在妊娠第20天其體質量值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1A。

2.3 尾動脈收縮壓差值的比較 各組間妊娠前、妊娠第4天大鼠尾動脈收縮壓差值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。0.5 mg/kg鎘處理組在妊娠第12天收縮壓開始升高，在妊娠第12天及第19天時其收縮壓升高值明顯大于對照組及非孕組（P＜0.05）。在妊娠第19天，0.25 mg/kg鎘處理組的孕鼠收縮壓升高值和非孕組比，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.52）。見圖1B。

2.4 24 h尿蛋白含量差值的比較 妊娠第19天，0.5 mg/kg鎘處理組出現的妊娠相關性的24 h尿蛋白升高值高于對照組、非孕組和0.25 mg/kg鎘處理組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；對照組和0.25 mg/kg鎘處理組的24 h尿蛋白升高值與非孕組比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1C。

圖1 各組大鼠體質量、收縮壓和24 h尿蛋白量比較

2.5 鎘誘導的孕鼠胎盤、腎臟、肝臟及腦組織的病理改變

2.5.1 肉眼觀察：對照組胎盤一般暗紅色，色澤均勻；而0.5 mg/kg鎘處理組胎盤大小變化不大，但個別胎盤周緣見褐色相間的鈣化帶。部分肝臟有少許粘連，顏色蒼白，部分大鼠出現輕度腹水。

2.5.2 組織學觀察：0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠胎盤組織見絨毛水腫，間質血管擴張充血，并見凋亡細胞。迷路區(qū)血管壁增厚，細胞退行性變，廣泛纖維蛋白沉積。蛻膜組織空泡變性和腫脹，少量炎細胞浸潤。0.5 mg/kg鎘處理組腎小球內皮細胞腫脹和間質腎小動脈管壁增厚，管腔狹窄，部分腎小管管腔可見蛋白管型。亦見炎性細胞浸潤。0.5 mg/kg鎘處理組肝竇淤血，肝細胞濁腫使肝索變窄，甚至出現局灶性壞死，匯管區(qū)少量炎細胞浸潤。0.5 mg/kg鎘處理組腦神經細胞變性、細胞周和血管周間隙增寬，血管充血及灶區(qū)出血。見圖2。

2.6 電鏡觀察染鎘后胎盤滋養(yǎng)細胞的超微結構變化 0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞胞質內細胞器減少。線粒體腫脹，嵴模糊斷裂甚至融合消失，呈空泡狀，線粒體膜融合，可見髓樣化；粗面內質網廣泛擴張，脫顆?，F象明顯；微絨毛數量減少，且排列紊亂甚至缺失；染色質聚集成塊，核膜模糊。見圖3。

3 討論

近年來隨著檢測技術的不斷進步及研究方法的不斷創(chuàng)新，對微量元素及其與妊娠高血壓疾病的關系認識不斷深入，發(fā)現多種微量元素，包括鈣、鎂、鋅、硒的缺乏以及鎘、鉛的過量與妊娠高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展有關[3]。鎘作為一種環(huán)境污染物，在人體內蓄積，對肝臟、腎臟和生殖系統(tǒng)均造成危害[4-5]。急慢性鎘暴露可直接引發(fā)和導致高血壓[6]。

圖2 0.5 mg/kg鎘處理組和對照組孕鼠的胎盤、腎臟、肝臟及腦組織的HE染色結果

圖3 0.5 mg/kg鎘處理組孕鼠胎盤滋養(yǎng)細胞超微結構變化

關于鎘對孕鼠胚胎毒性影響的研究結果報道不一，一般實驗研究多采用灌胃染毒或者腹腔注射的染毒方式[7]。本研究采用在妊娠第4～第19天每天腹腔注射不同濃度的氯化鎘（0.25、0.5 mg/kg）對SD孕鼠進行染毒。平均每只大鼠每天0.05～0.1 mg，染毒總劑量為4～8 mg/kg。結果發(fā)現0.5 mg/kg鎘處理組的大鼠于妊娠第10～第13天血壓逐漸升高，并出現蛋白尿、胎鼠體質量減輕等。病理檢查見胎盤血管充血，管壁增厚，纖維蛋白沉積，迷路區(qū)退化等。腎小球毛細血管內皮細胞腫脹，間質小動脈壁增厚等。鎘暴露的孕鼠出現典型的妊娠高血壓疾病樣的臨床癥狀和病理改變。在妊娠高血壓疾病發(fā)病機制的研究中，動物模型起著重要作用，有子宮胎盤缺血模型、炎癥模型、血容量增加模型等[8]。這些模型從不同方面重復出妊娠高血壓疾病的特點，而本研究成功地用重金屬鎘建立了妊娠高血壓疾病的動物模型。本研究發(fā)現對孕鼠注射0.5 mg/kg鎘8 d后即出現血壓升高。該劑量對于非孕組大鼠注射14 d后血壓相對于給藥前呈輕度升高，同樣劑量孕鼠平均增加的血壓和增加的尿蛋白量和非孕組相比均有顯著性差異。故在本研究中不管是血壓還是尿蛋白，孕鼠比非孕鼠對鎘的毒性體現了更高的敏感性，表明鎘對孕鼠有明顯的生殖毒性效應。鎘導致高血壓的機制包括誘導氧化應激、血管收縮、腎小管損傷、水鈉潴留和改變兒茶酚胺代謝等，而這些同樣是妊娠高血壓疾病的發(fā)病基礎。本課題組進一步研究還發(fā)現鎘通過多條途徑影響妊娠高血壓疾病的發(fā)展比如干擾胎盤的類固醇激素的分泌；增加胎盤DNA氧化損傷；上調B淋巴細胞中活化誘導的胞嘧啶核苷脫氨酶的表達，促進血管緊張素II1型受體自身抗體產生過多，激活補體造成器官損傷等，引起鎘對孕鼠一系列的生殖毒性效應及臨床病理表現[9-11]。

妊娠期間隨著孕齡的增長鎘在胎盤逐漸聚集，孕晚期胎盤里鎘的濃度明顯大于母血及臍帶血里濃度，說明胎盤也是鎘毒性的靶器官之一[12]。鎘在胎盤中的儲存本身并不是一個優(yōu)勢，因為這種金屬對胎盤功能有不利影響。鎘可能通過干擾胎盤的血流量、內分泌調節(jié)、人體所必需物質的轉運和代謝來影響胚胎的正常發(fā)育并間接影響母體的正常自我調節(jié)狀態(tài)[13]。有研究稱Wistar大鼠孕期鎘暴露導致胎盤鐵和鋅的轉運中斷，這可能會危及胎兒的營養(yǎng)與活力[14]。鎘對絨毛外滋養(yǎng)層細胞遷徙的研究結果表明，低濃度（0.5～1 μmol/L）的鎘離子雖然不影響滋養(yǎng)層細胞的存活，但能通過激活半胱天冬酶而影響肌動蛋白細胞骨架組織，以抑制配體誘導的滋養(yǎng)層細胞遷移[15]。此外鎘可引起活性氧和促炎性細胞因子的過量生成，都有可能導致妊娠高血壓疾病及胎兒宮內發(fā)育遲緩[16]。鎘在胎盤還可能會干擾胰島素樣生長因子軸或下調β胎盤11β-羥類固醇脫氫酶2型的活性，從而抑制胎兒生長[17]。鎘對胎盤的影響同時預示著其對子代發(fā)育的干擾，應引起足夠的重視。

本研究發(fā)現孕鼠暴露于0.5 mg/kg鎘以后出現24 h尿蛋白明顯升高，表明鎘對大鼠腎臟的損傷，由病理檢查可見損害部位主要包括腎血管及腎小管。短時接觸鎘對腎臟的損傷是輕微的，而長期接觸鎘引起的腎臟損害是不可修復的。鎘可以經過多重途徑進入體內，肝臟是鎘的主要蓄積部位之一，染鎘組大鼠肝出現肝細胞水腫變性甚至壞死、線粒體腫脹脊模糊等改變[18]。以往的研究報道鎘在腦內的分布往往都是較低水平[19]。本研究中染鎘組大鼠出現腦充血，腦水腫等病理改變?？赡芘c懷孕時母鼠血管擴張，血腦屏障減弱有關，小劑量連續(xù)鎘暴露能夠透過血腦屏障在雌性大鼠腦內蓄積，引起腦細胞變性等，出現易激惹和相互撕咬等臨床表現。

本研究通過注射鎘成功誘導妊娠高血壓疾病的大鼠模型，說明鎘是妊娠高血壓疾病發(fā)生的重要因素之一。