實(shí)驗(yàn)研究

劉 爽 高祥福 朱孝娟 劉會(huì)林 涂毅萍#

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院 浙江 杭州 310005

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雄性Wistar大鼠50只，體質(zhì)量220±20g，購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SYXK（浙）2017-0015。實(shí)驗(yàn)對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥物與儀器：真武湯（炮附子、茯苓、白芍、生姜各9g，白術(shù)6g）由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院一次性選購。福辛普利（蒙諾）購于中美上海施貴寶制藥有限公司，規(guī)格：10mg/片，批號(hào)：1705054。改良型RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、胰酶、PBS，均為HyClone 公司產(chǎn)品（美國），購自上海恒斐生物科技有限公司（北京）。2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽（細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒CCK-8）：日本同仁。25cm2一次性培養(yǎng)瓶、96孔板、24孔板：美國Corning公司。細(xì)胞級(jí)葡萄糖干粉：美國SIGMA公司。丙二醛（MDA）和過氧化氫酶（CAT）試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。倒置相差顯微鏡（ZEISS公司，Vert.A1），超凈工作臺(tái)（北京王堂藍(lán)翼科技有限公司，WT-IND），低速水平臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠，TDL-4），二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司，HF 151UV），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司，HWS-24），紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司，UV754N），酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems公司，Multiskan 354）。

1.3 含藥血清的制備：健康雄性Wistar大鼠50只，體重220±20g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、西藥對(duì)照組、真武湯低、中、高劑量組。真武湯低劑量組按18.9g/kg/d、真武湯中劑量組按37.8g/kg/d、真武湯高劑量組按75.6g/kg/d的真武湯灌胃給藥，西藥對(duì)照組按9mg/kg/d，正常組給予等體積生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)給藥7d。在末次灌胃前8～12h禁食禁水，于第7d末次給藥2h后采血，在無麻醉情況下（避免麻醉藥對(duì)血藥濃度和成分的影響）予以眼眶取血，3000rpm離心15min后取血清，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，經(jīng)0.22μm孔徑的針頭濾器過濾除菌，分裝-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)：HMCs 7～10代，接種于含10%的FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境37℃、含5%CO2、恒溫。細(xì)胞培養(yǎng)至生長狀態(tài)良好，至對(duì)數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 分組與給藥：實(shí)驗(yàn)分6組，即正常對(duì)照組、高糖組、西藥對(duì)照組、真武湯低、中、高劑量組。正常對(duì)照組予含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，高糖組予含10%正常大鼠血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，西藥對(duì)照組予含10%福辛普利含藥血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，真武湯低劑量組（1組）予含10%真武湯低劑量含藥血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，真武湯中劑量組（2組）予含10%真武湯中劑量含藥血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)，真武湯高劑量組（3組）予含10%真武湯高劑量含藥血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)干預(yù)。

1.6 觀察指標(biāo)：分述如下。

1.6.1 各組HMCs的增殖情況：取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液稀釋為單個(gè)細(xì)胞懸液，以4×103/孔細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加培養(yǎng)液100μl。將培養(yǎng)板置入CO2培養(yǎng)箱中。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁呈80%融合后改用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液饑餓24h，使細(xì)胞生長同步化于G0期。按24h、48h、72h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分組處理后，每孔加入CCK-8溶液10μl，37℃避光繼續(xù)孵育4h后取出，采用酶標(biāo)儀

在450nm波長處各孔測吸光度（A）值。

1.6.2 各組含藥血清對(duì)HMCs活性氧（ROS）表達(dá)的影響：細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約1×105個(gè)/ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用DCFH-DA標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞儀分別檢測48h、72h的各組細(xì)胞的ROS水平。

1.6.3 各組含藥血清對(duì)HMCs上清液中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活力和MDA含量的變化：將HMCs接種在24孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁生長至70%，更換為10%血清的培養(yǎng)液同步24h，按實(shí)驗(yàn)分組換為不同的培養(yǎng)液（1ml），分別于刺激的48h和72h收集上清液，1500r/min，離心10min后待測，按試劑盒說明書進(jìn)行SOD、GSH-PX活力和MDA含量的檢測。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：實(shí)驗(yàn)各組的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組數(shù)據(jù)之間采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HMCs不同時(shí)間點(diǎn)增殖情況比較：見表1。

2.2 各組含藥血清對(duì)HMCs ROS表達(dá)的影響：見表2。

2.3 各組含藥血清對(duì)人腎小球系膜細(xì)胞上清液中SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響：見表3。

表1 各組HMCs不同時(shí)間點(diǎn)增殖情況比較（±s）

表1 各組HMCs不同時(shí)間點(diǎn)增殖情況比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01；與48h比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常組高糖組西藥對(duì)照組真武湯1組真武湯2組真武湯3組0.334±0.086##0.658±0.109**##0.568±0.121**##0.628±0.101**##0.609±0.098**##0.510±0.056**&&##0.970±0.137 1.368±0.097**1.210±0.109**&&1.246±0.118**&1.216±0.117**&1.179±0.094**&&0.983±0.095 1.388±0.068**1.106±0.123**&
.201±0.050**&&1.144±0.068**&
.091±0.058*&&#

表2 不同處理因素對(duì)HMCs ROS表達(dá)的影響（±s）

表2 不同處理因素對(duì)HMCs ROS表達(dá)的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與高糖組比較，&P＜0.05；與西藥對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常組高糖組西藥對(duì)照組真武湯1組真武湯2組真武湯3組6.45±0.62 27.15±1.99*13.48±1.10*&17.43±0.78*.13±1.40*&##10.48±1.05*.47±1.33 30.45±2.15*17.58±0.70*&20.15±1.71*.63±1.24*&##13.60±1.31*&#

表3 各組含藥血清對(duì)SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響（±s）

表3 各組含藥血清對(duì)SOD、GSH-PX活力和MDA含量的影響（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01；與西藥對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

正常組高糖組西藥對(duì)照組真武湯1組真武湯2組真武湯3組10 10 10 10 10 10 1.756±0.131 0.732±0.041*1.439±0.147*&0.881±0.109*&
.386±0.122*&1.601±0.097**&##4.105±0.108 2.223±0.107*3.158±0.112*&2.727±0.195*.261±0.132*&3.442±0.112*.254±1.071 6.652±0.784*10.357±0.825*&7.704±0.673*&.241±0.748* .507±0.646*&16.365±0.982 9.682±0.636*13.710±0.614*&11.568±0.464*.850±0.530*&##14.563±0.618*&##1.003±0.064 3.411±0.113*1.731±0.098*&3.038±0.156*.017±0.104*
.613±0.080*&##1.200±0.092 4.114±0.086*1.821±0.082*&3.540±0.116*.216±0.112*
.669±0.057*&#

3 討論

真武湯系《傷寒論》之方，用于治療少陰病陽虛水泛及太陽病發(fā)汗傷陽，致陽虛水動(dòng)諸癥。全方溫陽與利水并用且佐以斂陰之品，使之溫?zé)岵粋?，斂陰不助邪，被后世醫(yī)家廣泛應(yīng)用于腎臟相關(guān)疾病的治療。

HMCs是腎小球內(nèi)最為活躍的細(xì)胞，其過度的增殖是導(dǎo)致腎小球硬化、腎臟纖維化的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖對(duì)HMCs的分泌功能、多元醇代謝、細(xì)胞基質(zhì)合成等均有一定影響，而這與糖尿病腎?。―KD）早期高濾過的表現(xiàn)有關(guān)。本研究通過觀察HMCs在高糖培養(yǎng)下不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況，發(fā)現(xiàn)HMCs的增殖在高糖培養(yǎng)下呈現(xiàn)雙向過程。給予含藥血清干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，24h時(shí)，與高糖組比較，只有真武湯高劑量組對(duì)HMCs的增殖起到一定抑制作用，其余治療組無效，而48h和72h時(shí)，西藥對(duì)照組及真武湯低、中、高劑量組均出現(xiàn)對(duì)HMCs增殖的抑制作用，且有顯著性差異。由此推斷，真武湯對(duì)高糖培養(yǎng)下HMCs增殖的抑制作用有時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系和劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系?？梢姡嫖錅芡ㄟ^抑制HMCs的增殖來保護(hù)腎臟，從而延緩DKD進(jìn)展。至于具體途徑，本研究選擇了氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)一步探索真武湯的作用機(jī)制。研究結(jié)果表明，真武湯具有抑制ROS生成的作用，進(jìn)而減輕HMCs的氧化應(yīng)激水平，同時(shí)，真武湯還能提高SOD和GSH-PX的活力，而這兩個(gè)指標(biāo)活性的增強(qiáng)意味著HMCs抗氧化能力的增強(qiáng)。此外，實(shí)驗(yàn)中MDA水平的降低，反映了細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的下調(diào)，以上都說明真武湯具有降低氧化應(yīng)激水平的作用，從而發(fā)揮保護(hù)腎功能，防治DKD的功效。