婁可心， 羅守華， 張園， 顧寧， 劉方舟

頭頸部腫瘤是人體常見惡性腫瘤之一，占全身惡性腫瘤3%，其中90%為上皮源性鱗狀細胞癌，近年來發(fā)病率持續(xù)上升，發(fā)病年齡也趨于年輕化[1-5]。頭頸部解剖結構復雜，隨著腫瘤發(fā)展，常多方向侵犯、累及多個部位及鄰近器官。頭頸部鱗狀細胞癌擴散主要途徑是通過區(qū)域淋巴結轉移，≥80%頭頸部惡性腫瘤發(fā)生頸部淋巴結轉移，這是頭頸部腫瘤患者難治、致死的重要原因[6]。建立頭頸部腫瘤的動物模型，對進一步研究其發(fā)病及轉移機制，尋找積極有效的診斷及治療方案有重要意義。

1968年從1例印度下咽骨腫瘤患者的鉆孔活組織切片(人咽鱗癌細胞)中建立了FaDu瘤細胞株。在建立細胞株中發(fā)現(xiàn)細胞質含有成束細絲，并且細胞上橋粒特別突出[7]。FaDu是一種較穩(wěn)定的可移植腫瘤細胞株，與頭頸部腫瘤多數(shù)低分化鱗癌有病理共性[8]。FaDu可在實驗動物體內接種，具有較高的局部淋巴結轉移及肺、肝等遠處轉移特性，在大型動物模型研究上具有較高的應用價值。本研究在裸鼠喉咽部建立FaDu頭頸部腫瘤動物模型，觀察其CT表現(xiàn)和病理學，研究該動物模型的穩(wěn)定性及實驗價值。

1 材料與方法

1.1 造模動物及材料

無特定病原體遠系雜交BALB/c裸鼠30只(購自南京醫(yī)科大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(蘇2013-0016)，雌雄不限，鼠齡5～6周齡，體質量(18.1+0.5)g，SPF條件下飼養(yǎng)(東南大學醫(yī)學院動物實驗中心)。實驗前動物適應新環(huán)境5 d。裸鼠單只飼養(yǎng)，保持恒定環(huán)境，溫度20～25 ℃，濕度60%，每天飲水和進食隨意。所有實驗均在白天進行。所有實驗操作均在30 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔靜脈麻醉后進行。FaDu瘤細胞株由上海中國科學院細胞庫提供。本研究通過南京醫(yī)科大學動物倫理學委員會批準，實驗用動物均符合動物倫理學要求。

1.2 荷瘤裸鼠制備

1.2.1 制備過程 癌細胞接種常規(guī)培養(yǎng)FaDu細胞，取對數(shù)生長期FaDu細胞，用0.25%胰酶消化，PBS洗細胞2次，1 000 r/min(12 000 rpm 15 cm)離心5 min，收集細胞，用0.9%氯化納溶液懸浮細胞，定容，細胞以5×106個(0.2 ml/只)接種于裸鼠喉部。裸鼠喉部定位方法：裸鼠麻醉后頸過伸位，標記甲狀軟骨板位置，用18號穿刺針穿過甲狀軟骨板，有落空感后退針注射腫瘤細胞懸液，緩慢退出針頭，并用無菌紗布塊壓迫針孔數(shù)分鐘，以防止瘤細胞滲漏及出血。

1.2.2 裸鼠成瘤情況 自腫瘤種植成功起，每天觀察實驗鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動等一般生命體征。每2～3天用游標卡尺測量腫瘤長徑(a)及短徑(b)，取各組長短徑均值，按公式ab2/2計算腫瘤體積。

1.2.3 病理檢查 剝取腫瘤塊，4%甲醛固定。自固定液中取出標本，流水沖洗30 min；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；浸蠟，包埋。以3 μm厚度連續(xù)切片；常規(guī)烘片脫蠟(60 ℃、10 min)；二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；HE染色3 min；1.0%鹽酸乙醇分化數(shù)秒；自來水沖洗5 min；pH 7.5～8.0稀氨水浸泡數(shù)秒，自來水沖洗5 min；梯度乙醇脫水；二甲苯透明；中性樹膠封固。在顯微鏡下行常規(guī)腫瘤組織病理檢查。

2 結果

2.1 裸鼠成瘤情況觀察

平均15 d，裸鼠喉咽部出現(xiàn)種植瘤，直徑0.4～0.5 cm，成瘤率100%(30/30)，并且隨時間增加而增大，無自發(fā)消退現(xiàn)象，見圖1。由于移植瘤生長，實驗裸鼠出現(xiàn)張口呼吸，這是由于移植瘤長大堵塞呼吸道所致。所有實驗裸鼠到晚期均出現(xiàn)呼吸急促、發(fā)紺，最后全身衰竭而死亡。

圖1 原位種植瘤模型外觀裸鼠原位種植瘤模型，可見腫瘤位于頸部氣管前，局部侵犯裸鼠頸前皮下

2.2 病理結果

裸鼠種植瘤HE染色，腫瘤細胞與人喉咽鱗癌相似，生長良好，詳見圖2。

圖2 裸鼠種植瘤病理切片(HE ×200)細胞核大深染，核分裂象多見，可見癌巢

2.3 影像學結果

腫瘤種植成功后第2、3、4、5周行小動物microCT(蘇州海斯菲德公司His can VM)掃描，觀察腫瘤大小及侵犯部位。CT掃描方法：進行橫軸位掃描，掃描層厚為3 mm，采用0.3 mm間隔[9-12]。種植腫瘤表現(xiàn)為等/稍高信號。見圖3。

圖3 原位種植瘤microCT圖像裸鼠microCT圖片，裸鼠喉部聲門上區(qū)顯示清楚，腫瘤主要位于喉咽部，向外生長侵及裸鼠頸前皮下

3 討論

自1969年首次成功將人結腸癌進行裸鼠體內傳代種植開始，裸鼠便廣泛地用于人類腫瘤的實驗研究[13]。至今發(fā)現(xiàn)幾乎所有人惡性腫瘤均能在裸鼠上種植。種植物通常分為3種：① 腫瘤外科標本直接進行種植；② 通過其他宿主系統(tǒng)建立腫瘤可種植株；③ 體外培養(yǎng)腫瘤細胞系的種植。裸鼠用作腫瘤種植實驗方法簡單，無需對動物作特殊前處理，并且異種腫瘤種植成功率高。種植傳代的腫瘤組織盡可能保留了原有的生物學特性，種植瘤可在裸鼠體內或體表生長，瘤體生長類型基本相同。皮下種植瘤體通常與皮膚及皮下組織無粘連，易于分離，便于觀察、測量和進行活體檢查，種植瘤原有的形態(tài)與生物學特性基本保持不變。腫瘤細胞染色體核型分析表明，傳代腫瘤仍保留原腫瘤核型，用其他同工酶及免疫方法分析，發(fā)現(xiàn)人類惡性腫瘤種植傳代后的瘤體仍保持人類惡性腫瘤的特點。

影響種植成功因素包括：種植部位及接種途徑、接種物含量、接種物濃度、腫瘤類型、動物營養(yǎng)狀況等。對于本模型來說，應考慮以下影響因素：① 性別，如肝癌、前列腺癌易種植于雄性裸鼠，乳腺癌則在雌性裸鼠體內生長得更好[14]。② 鼠齡，裸鼠鼠齡也是重要因素，一般選擇4～6周齡裸鼠進行實驗。如鼠齡過大，裸鼠體內產(chǎn)生較多NK細胞，影響腫瘤種植成功率。③ 接種瘤細胞量，接種量過少，種植瘤不易成活；接種量過大，則引起腫瘤失控生長，對以后實驗干預帶來負面影響。一般認為以5×106個/(0.2 ml/只)為較適宜接種劑量[15]。④ 裸鼠營養(yǎng)狀況，裸鼠體重輕，營養(yǎng)狀態(tài)不佳時腫瘤通常生長較慢，加喂熟雞蛋黃后營養(yǎng)狀況明顯改觀。本研究用4～6周齡裸鼠進行實驗，人喉咽癌細胞株FaDu以5×106個/(0.2 ml/只)接種于裸鼠喉咽部，成功建立人喉咽癌裸鼠種植瘤模型。該模型種植成瘤率達100%(30/30)，腫瘤生長穩(wěn)定。

鱗狀細胞癌是頭頸部常見癌癥，占所有新確診癌癥病例3%[16]。過去幾十年盡管在腫瘤細胞和分子生物學方面開展大量研究，運用最新腫瘤治療和外科手術，但頭頸部鱗狀細胞癌患者死亡率和發(fā)病率一直居高不下，因此，探索頭頸部腫瘤發(fā)病機制進行積極的診療非常重要。國內外學者對頭頸部鱗狀細胞癌進行了大量基礎及臨床研究。以往研究多采用小鼠做為研究對象來誘發(fā)腫瘤，但有些學者發(fā)現(xiàn)小鼠與人類頭頸部鱗狀細胞癌在某些特性上有差異。沈毅等[17]通過建立兔舌不同部位VX2鱗癌和頸淋巴結轉移模型，對其生物學特性進行研究，發(fā)現(xiàn)與人類基本一致，生長迅速、容易轉移，是較理想的動物腫瘤模型[18]。本實驗鑒于FaDu腫瘤生物學特性與人類鱗狀細胞癌具有較高相似性，采用裸鼠做為實驗動物，喉咽移植瘤成功率達100%，可能因位置相對表淺，操作方便，注射腫瘤細胞懸液量容易控制，保證植入腫瘤細胞懸液活性所致。

本研究證明通過此種方法可在短期內大批量建立所需喉咽癌動物模型，其穩(wěn)定性和重復性較好，成瘤率可達100%，根據(jù)觀察晚期可發(fā)生頸淋巴結轉移和肺轉移，臨床癥狀同人類十分相似，為研究頭頸部腫瘤及淋巴結轉移提供依據(jù)。由于腫瘤種植的部位位于喉咽部，喉咽部移植對周圍組織侵犯范圍較廣，可侵及氣管、甲狀腺、肌肉等鄰近重要器官。實驗裸鼠在第4～5周由于腫瘤過大影響呼吸，窒息死亡。同時也要注意注射腫瘤細胞懸液時局部壓力過高可導致“注射播散”，另外，腫瘤細胞注射到血管內，出現(xiàn)肺轉移和淋巴結轉移也應引起注意。