仇朝紅 馬元龍

【摘要】目的 增訂流感丸中烏頭堿限量檢查方法。方法 采用薄層色譜法，高效液相色譜法，Sunfire-ODS C18柱（250 mm，4.6 mm）；柱溫：30℃室溫；流動相：以甲醇-0.1%三乙胺（65：35）為流動相；檢測波長240 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算均高于2000。結(jié)果 供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。流感丸中不含烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，含有異葉烏頭堿、苯甲酰異葉烏頭堿、阿替新等生物堿，這三種生物堿毒性較小，如異葉烏頭堿對小鼠LD50（靜注）為180～190 mg/kg，為烏頭類生物堿中毒性較低的種類。結(jié)論 通過對薄色譜鑒別項(xiàng)方法學(xué)驗(yàn)證，所增訂的薄層色譜法方法可行，重現(xiàn)性良好，陰性無干擾；高效液相定性方法可行，重現(xiàn)性良好，分離度好，陰性無干擾，該方法可作為流感丸中烏頭堿的定量控制。

【關(guān)鍵詞】流感丸；烏頭堿；薄層色譜；高效液相色譜

【中圖分類號】R259 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.28..02

流感丸用于清熱解毒，用于流行性感冒，流清鼻涕，頭痛咳嗽，周身酸癰，炎癥發(fā)燒等。本實(shí)驗(yàn)建立了流感丸中烏頭堿的薄層色譜鑒別和效液相色譜定性測定方法

1 薄層色譜法

1.1 檢測方法

取本品粉末15 g，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液20 mL溶解，用三氯甲烷20 mL振搖提取，棄去三氯甲烷液，水液用碳酸氫鈉試液調(diào)節(jié)PH值至8～9，用三氯甲烷振搖提取2次，15 mL/次，合并三氯甲烷液，用無水硫酸鈉脫水，蒸干，殘?jiān)眉状既芙馐钩? mL，作為供試品溶液。另取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對照品，加甲醇制成每1 mL含1.0 mg的溶液，作為混合對照品溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取供試品溶液10 μL、混合對照品溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（8：4：4：1）為展開劑，置氨蒸汽飽和20 min的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。

1.2 方法學(xué)考察

供試品溶液制備方法同上。

陰性樣品溶液制備：按處方比例去除草烏、榜嘎藥材，并按上述供試品溶液方法方法制備。

供試品提取方法及色譜條件的考察：方法中對不同極性提取溶劑進(jìn)行了考察（乙醇、甲醇、異丙醇-乙酸乙酯），對不同提取方法進(jìn)行了考察（冷浸、超聲、回流），對不同提取時間進(jìn)行了考察（1 h、2 h、3 h），考察了不同展開劑：三氯甲烷-環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（8：4：4：1）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇（6.4：3.6：1）。

1.3 結(jié)果

最后試驗(yàn)結(jié)果表明，采用加乙醇50 mL，加熱回流2 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?%鹽酸溶液20 mL溶解，用三氯甲烷20 mL振搖提取，棄去三氯甲烷液，水液用碳酸氫鈉試液調(diào)節(jié)PH值至8～9，用三氯甲烷振搖提取2次，15 ml/次，合并三氯甲烷液，用無水硫酸鈉脫水，蒸干，殘?jiān)眉状既芙馐钩? mL，展開劑用正己烷-乙酸乙酯（9：1），薄層板用硅膠G板，噴以稀碘化鉍鉀試液后在日光下檢視的方法斑點(diǎn)分離良好，特征明顯，陰性溶液無干擾。

1.4 檢驗(yàn)結(jié)果

供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，3批樣品均未顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)分離良好，特征明顯，陰性溶液無干擾，可作為流感丸中烏頭堿限量檢查的方法。

2 高效液相色譜法

流感丸原藥材棒嘎藥材中烏頭堿定性測定研究

2.1 儀器與試藥

2.1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2487 DAD檢測器，Empower Pro化學(xué)工作站；電子天平，德國賽多利斯股份公司）；電子天平；超聲波清洗器。

2.1.2 試藥

烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品，購自中國藥品生物制品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2.2 方法與結(jié)果

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

參照《中國藥典》[1]2010年版一部川烏、草烏中的烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿的含量測定方法及隨志剛等對草烏中烏頭類生物堿提取方法比較研究，選擇以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.1%三乙胺（65：35）為流動相；檢測波長240 nm。理論板數(shù)按烏頭堿峰計(jì)算均高于2000。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取烏頭堿對照品12.97 mg、次烏頭堿對照品9.96 mg、新烏頭堿對照品11.88 mg，分別置100 mL量瓶中，加異丙醇一三氯甲烷（1：1）混合溶液溶解，定容至刻度，即得烏頭堿濃度為0.1281 mg/mL、次烏頭堿濃度為0.0991 mg/mL和新烏頭堿濃度為0.1170 mg/mL的溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

2.2.3.1 提取方法的考察

（1）方法一：取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加氨試液3 mL，精密加入異丙醇一乙酸乙酯（1：1）混合溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯（1：1）混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25 mL，40℃以下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤氘惐?三氯甲烷（1：1）混合溶液3ml溶解，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（2）方法二：酸提法，取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用0.05 mol/L鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，于12000 r/min離心5 min，上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）方法三：酸超聲提乙醚萃取法，取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz；水溫在25℃以下）30 min，放冷，再稱定重量，用0.05 mol/L鹽酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，于12000 r/min離心5 min，取上清液，用10%氨水調(diào)pH值為10，加入15，5，5 mL乙醚萃取三次，合并乙醚層，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL，即得。

（4）方法四：氨水乙醚冷浸法，取草烏藥材粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入40 mL10%氨水，加乙醚30 mL，振蕩5 min，冷浸6 h，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，3000 r/min離心5 min，取乙醚層，沉淀用乙醚洗滌2次，10 mL/次，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容?5 mL，即得。

3 討 論

檢測結(jié)果與所查文獻(xiàn)結(jié)論一致，草烏中不含烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，含有異葉烏頭堿、苯甲酰異葉烏頭堿、阿替新等生物堿[2]，這三種生物堿毒性較小，如異葉烏頭堿對小鼠LD50（靜注）為180～190 mg/kg[3]，為烏頭類生物堿中毒性較低的種類。又加這三種生物堿對照品屬于冷僻品種，我們多方求購，至今沒有買到，故未能對這三種生物堿進(jìn)行定量研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉高宏，魏立莉.流感丸中烏頭堿的限量檢查及HPLC含量測定方法的建立[J].西部中醫(yī)藥，2016，29（11）：24-26.

[2] 張有新，仇朝紅，劉學(xué)良，等.流感丸中烏頭堿含量測定研究[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2017，4（38）：7497-7498.

[3] 戴衛(wèi)平，李 耿，申小花，等.眾生丸對 H1N1流感小鼠的保護(hù)及免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2015，16（4）：395-399.

本文編輯：劉欣悅