劉兆宇 姚文霞 梁 雪

蛞蝓，又名蜒蚰、托胎蟲、蛞蝸、鼻涕蟲，是最早收載于《本草綱目》的民間用于治療肺氣腫的傳統(tǒng)中藥，隸屬于軟體動(dòng)物門中的腹足綱肺螺亞綱，治療喘息、喉痹等。高突足襞蛞蝓是蛞蝓品種之一，在我國(guó)主要分布南方亞熱帶及沿海地區(qū)，據(jù)載尤以廣西百色地區(qū)的質(zhì)量最佳。據(jù)《本草綱目》等記載蛞蝓可用于治療喘息、喉痹、癰腫等，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)其具有降低支氣管炎[1]、哮喘[2]、過敏[3]、肺氣腫[4]等作用。前期已有報(bào)道具有多糖和蛋白特征的高突足襞蛞蝓水提物能通過減少氣道粘蛋白表達(dá)、減少巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)等改善COPD小鼠氣道炎癥[5]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用高效液相色譜(HPLC)、凝膠滲透色譜(GPC)、氣相色譜-質(zhì)譜對(duì)蛞蝓提取物多糖的具體單糖組成、相對(duì)分子量大小及相應(yīng)的抗氧化活性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步研究蛞蝓藥理活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBCO)；胎牛血清(GIBCO)；青-鏈霉素雙抗(吉諾生物)；SOD活力檢測(cè)試劑盒(南京建成，A001-3)；CellROX?熒光探針(Thermo, C10443)；葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)；超純水制備機(jī)(MILLIPORE)；養(yǎng)生破壁萃取機(jī)(佛山益爾康)；高速冷凍離心機(jī)(BECKMAN COULTER)；冷凍干燥機(jī)(VirTis)；高效液相色譜儀(Agilent 1260 Infinity，美國(guó)安捷倫公司)；色譜柱：TOSOH TSK gel G4000SWXL(300 mm×7.8 mm,10 μm)，TOSOH TSK gel G3000SWXL(300 mm×7.8 mm,5 μm)串聯(lián)；熒光導(dǎo)致顯微鏡(Leica, DMi8)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高突足襞蛞蝓受試物的提取 新鮮速凍蛞蝓全蟲1 kg解凍，清洗去除其中的泥沙、雜草等，稍稍控干，用養(yǎng)生破壁萃取機(jī)攪碎，2000 r/min低溫離心10 min，收集上清液，殘?jiān)觗dH2O反復(fù)如上操作，最后合并上清液，使終體積為4 L。將最終得到的提取液4℃靜置過夜，除脂，冷凍干燥24～48 h，得淡黃色粉末。

1.2.2 受試物的提取放大試驗(yàn) 為檢驗(yàn)高突足襞蛞蝓受試物提取工藝的穩(wěn)定性，按2.1中完整提取工藝，中試三批樣品。采用苯酚-硫酸法進(jìn)行多糖定量、采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定。

1.2.3 高突足襞蛞蝓受試物脫蛋白處理 制備高突足襞蛞蝓受試物1 mg/mL，向溶液中加入Sevage 試劑(氯仿 ∶正丁醇 =4 ∶1，V/V)200 ml，于水平振蕩器中振蕩30 min，以4 000 r/min 的速度離心15 min，收集上層水相，重復(fù)4次。將得到的溶液凍干，即得蛞蝓脫蛋白受試物。

1.2.4 高突足襞蛞蝓受試物多糖含量、分子量分布及單糖組成的測(cè)定 本部分實(shí)驗(yàn)委托中國(guó)廣州分析測(cè)試中心進(jìn)行檢測(cè)。分別采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-M S)、高效液相色譜(HPLC)分析高突足襞蛞蝓受試物多糖的單糖組成，用凝膠滲透色譜(GPC)分析高突足襞蛞蝓受試物多糖的相對(duì)分子量及其分布[6]。

1.2.5 煙草提取物的制備及上皮細(xì)胞培養(yǎng) 煙草提取物臨用前提取配制。在兩個(gè)串聯(lián)的大包氏管內(nèi)各加入5 mL基礎(chǔ)DMEM高糖培養(yǎng)基，然后在串聯(lián)管的起始端濾頭上連接一根剝掉濾嘴的卷煙，在串聯(lián)管的末端連接一個(gè) 50 mL的注射針筒。點(diǎn)燃卷煙后，使用注射針筒以50 mL/10 s的速度抽吸，使煙霧溶于培養(yǎng)基形成氣溶膠，每次 2支卷煙，每支卷煙用注射器抽吸 10次。收集培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)其PH值為 7.4，使用 0.22 μm 濾器過濾除菌，得到100%的CSE原液，實(shí)驗(yàn)時(shí)按需求稀釋成不同濃度 CSE。

16HBE細(xì)胞用含10%FBS、1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至80～90%匯合鋪板。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用相應(yīng)蛞蝓受試物按照1 mg/mL的濃度用基礎(chǔ)DMEM高糖培養(yǎng)基制備，渦旋混合均勻，0.22 μm 濾器過濾除菌，然后分別以1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL對(duì)16 HBE細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，1%CSE暴露刺激16HBE細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷。

1.2.6 CSE誘導(dǎo)上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激及指標(biāo)檢測(cè) 采用1%CSE暴露刺激16HBE細(xì)胞24 h，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。分別設(shè)置陰性對(duì)照處理組(DMEM)、受試物處理對(duì)照組1(蛞蝓受試物)、受試物處理對(duì)照組2(蛞蝓脫蛋白受試物)、模型處理組(CSE)、模型+受試物處理組1(CSE+蛞蝓受試物)、模型+受試物處理組2(CSE+蛞蝓脫蛋白受試物)，在給予CSE的同時(shí)各組給予相應(yīng)處理。收上清，酶標(biāo)法檢測(cè)超氧化物歧化酶(SOD)活力；細(xì)胞加入終濃度為5 μm的CellROX?熒光探針，37 ℃孵育30 min，PBS洗3遍，熒光倒置顯微鏡40倍鏡下觀察胞質(zhì)ROS水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 高突足襞蛞蝓提取物制備及工藝穩(wěn)定性考察

高突足襞蛞蝓提取物制備流程如圖1所示，500 g高突足襞蛞蝓約得到提取物24 g，產(chǎn)率約為6%。接著模擬工業(yè)化生產(chǎn)的條件下進(jìn)行工藝考察，以驗(yàn)證放大生產(chǎn)后原工藝的可行性，保證批次間提取物的質(zhì)量一致性。結(jié)果表明：3批中試樣品，成品提率基本一致，多糖提率和蛋白提率基本一致，且批次間標(biāo)準(zhǔn)偏差約4%，確定本品的提取工藝經(jīng)放大可行，同時(shí)比較穩(wěn)定(見表1)。

圖1 高突足襞蛞蝓提取工藝流程

活蝓量/kg成品性狀成品量(g)得率(%)多糖量(g)多糖率(%)蛋白量(g)蛋白率(%)150淡黃色9 0606.042 0101.342 5601.71150淡黃色8 9305.952 0101.382 6901.70156淡黃色9 5005.942 2601.412 8301.77

2.2 高突足襞蛞蝓提取物的多糖特征及單糖組成

分別采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、高效液相色譜(HPLC)分析提取物多糖的單糖組成，結(jié)果表明：高突足襞蛞蝓受試物主要含有半乳糖(57.53%)、葡萄糖(17.28%)、甘露糖(9.75%)、果糖(7.12%)、阿拉伯糖(3.44%)、核糖(2.64%)、鼠李糖(2.25%)。脫蛋白處理前后，單糖組成一致(見表2)。采用凝膠滲透色譜(GPC)分析高突足襞蛞蝓相對(duì)分子量M r 及其分布，結(jié)果表明：蛞蝓受試物多糖的GPC峰的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量(M n) 為1.33×104，重均分子量(Mw)為3.90×105；蛞蝓脫蛋白受試物多糖的GPC 峰的M n 為4.57×103，重均分子量(Mw)為1.40×104。經(jīng)脫蛋白處理，高突足襞蛞蝓的分子量分布寬度顯著減少(見圖2，圖3)。

表2 高突足襞蛞蝓脫蛋白前后多糖單糖組成特征

圖2 高突足襞蛞蝓脫蛋白前后多糖GPC峰圖

組成分子量(Molecular weight)數(shù)均分子量(Mn)重均分子量(Mw)分布寬(D)高突足襞蛞蝓受試物1.33×1043.90×10529.4高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物4.57×1031.40×1043.06

2.3 高突足襞蛞蝓受試物改善CSE誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激

ROS是氧化應(yīng)激條件下細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧，直接反應(yīng)了細(xì)胞氧化應(yīng)激水平；SOD對(duì)細(xì)胞抗氧化功能起著至關(guān)重要的作用，其活性直接反應(yīng)細(xì)胞的抗氧化能力。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CSE暴露可誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞ROS表達(dá)增強(qiáng)，SOD水平顯著降低；與模型組相比，經(jīng)高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物處理后，16HBE細(xì)胞的ROS表達(dá)明顯降低，相應(yīng)的SOD水平顯著增加(見圖3、圖4)。

3 討論

氧化應(yīng)激損傷是目前認(rèn)為的慢性阻塞性肺疾病(COPD)的發(fā)病機(jī)制之一。煙草煙霧常見室內(nèi)污染物之一，是由上千種化學(xué)物質(zhì)組成的復(fù)雜混合物，煙草煙霧暴露能夠引起機(jī)體呼吸道氧化損傷[7-8]，而氣道上皮細(xì)胞是組成機(jī)體氣道屏障的第一防線，會(huì)首先出現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷[9]。關(guān)于煙草煙霧暴露誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激信號(hào)通路激活已有報(bào)道[10]，正常情況下機(jī)體保持自由基生成和清除的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，煙草煙霧暴露會(huì)打破這個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，激活氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧自由基ROS，機(jī)體抗氧化能力(如SOD酶活力)降低，同時(shí)引發(fā)氧化應(yīng)激損傷[11-14]。已有報(bào)道雙線嗜粘液蛞蝓多糖具有抗氧化活性[15]，因此本研究采用煙草煙霧提取物CSE暴露處理16HBE，模擬吸煙所致的氣道上皮氧化應(yīng)激，通過ROS、SOD指標(biāo)觀察高突足襞蛞蝓提取物中多糖組分的抗氧化效果。中藥提取物的質(zhì)量控制是中藥藥效研究的重要影響因素[16-17]，本研究以多糖和蛋白為主要質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)證實(shí)高突足襞蛞蝓水提物的提取工藝穩(wěn)定性，以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用受試樣品質(zhì)量具有較好的一致性，同時(shí)也證實(shí)了受試物制備工藝穩(wěn)定性較好，經(jīng)放大實(shí)驗(yàn)仍然能保證受試樣品批次間產(chǎn)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。多糖通常是由多種單糖組成，而單糖組成與體外的抗氧化活性有較強(qiáng)的相關(guān)性[18]。通過分析高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物中多糖的單糖組成、相對(duì)分子質(zhì)量及其分布，發(fā)現(xiàn)高突足襞蛞蝓受試物經(jīng)脫蛋白處理前后，單糖的基本組成并無改變，二者相應(yīng)的抗氧化效果也較為接近。但是經(jīng)脫蛋白處理前后的兩種足襞蛞蝓受試物，其單糖組成比例有所改變，受試物中關(guān)鍵單糖的所占比例改變，使得原有的改善SOD酶活力的效果更加明顯而不依賴于“劑量-效應(yīng)”關(guān)系，因此如果能進(jìn)一步找到足襞蛞蝓天然多糖組成的關(guān)鍵單糖，勢(shì)必能夠?yàn)樘岣咦泗膨因醯目寡趸Ч峁?shí)驗(yàn)依據(jù)。經(jīng)脫蛋白處理后，受試物的相對(duì)分子質(zhì)量明顯變小、分布寬明顯變窄提示脫蛋白處理對(duì)高突足襞蛞蝓中的多糖含量有一定影響，推測(cè)足襞蛞蝓多糖天然狀態(tài)下可能是與蛋白形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，因此會(huì)受到化學(xué)法脫蛋白過程的影響。這與先前報(bào)道的雙線嗜粘液蛞蝓具有多糖肽鏈結(jié)構(gòu)較為一致[15]。而足襞蛞蝓脫蛋白受試物的抗氧化效果并未受到化學(xué)法脫蛋白過程的影響，反而提高了低劑量受試物的SOD酶活力，提示足襞蛞蝓受試物中抗CSE誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要組分是其中的多糖。COPD是一種氣道慢性非特異性炎癥引發(fā)的呼吸疾病，氣道的上皮屏障損傷、炎癥細(xì)胞持續(xù)浸潤(rùn)都是引起呼吸道損傷重塑進(jìn)而導(dǎo)致肺氣腫的關(guān)鍵機(jī)制[19-20]。本研究中，我們通過觀察足襞蛞蝓提取物多糖對(duì)氣道上皮屏障抗氧化應(yīng)激的效果，揭示足襞蛞蝓在COPD肺氣腫形成初期可能存在潛在的預(yù)防保護(hù)作用。然而天然多糖具有多種生物學(xué)功能，參與細(xì)胞生物信息傳遞、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等[21]。因此，除了抗氧化應(yīng)激外，足襞蛞蝓提取物多糖是否同時(shí)兼具調(diào)節(jié)免疫作用，抑制肺部及氣道炎癥，后續(xù)還需要進(jìn)一步研究。

圖3 高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物處理改善CSE誘導(dǎo)的SOD活性降低

圖4 高突足襞蛞蝓受試物及高突足襞蛞蝓脫蛋白受試物處理降低CSE誘導(dǎo)的ROS增加

綜上所述，高突足襞蛞蝓的多糖數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量(M n) 為1.33×104，重均分子量(Mw)為3.90×105，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖組成。經(jīng)脫蛋白處理后，相對(duì)分子質(zhì)量降低，但是單糖組成比例基本不變。高突足襞蛞蝓能降低CSE刺激人氣道上皮細(xì)胞引起的ROS釋放，同時(shí)增強(qiáng)SOD酶活力，初步判斷其抗氧化組分主要為其中的多糖組分。針對(duì)確切的抗氧化應(yīng)激組分，還需要進(jìn)一步研究分析。