吳菊花 劉無逸 (廣西科技大學(xué)，廣西 柳州 545006)

胰島素抵抗與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展緊密相聯(lián)，可使機(jī)體產(chǎn)生心肌梗死、糖尿病性心肌病等疾病，其過程中易產(chǎn)生心肌脂質(zhì)代謝紊亂。有研究表明，心肌細(xì)胞脂質(zhì)代謝及能量代謝紊亂可能導(dǎo)致心肌產(chǎn)生多種疾病〔1，2〕。而過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化酶活性、促進(jìn)脂代謝、改善血脂及抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面作用顯著，尤其在脂代謝和糖代謝方面扮演重要角色，已引起眾多學(xué)者關(guān)注〔3，4〕。PPARγ是PPARs亞型之一，是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，可增加脂肪細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)脂肪細(xì)胞三酰甘油合成，有效調(diào)劑脂質(zhì)代謝過程，經(jīng)激動(dòng)劑激活后也可增強(qiáng)胰島素敏感性。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)下，胰島素抵抗大鼠心肌PPARγ表達(dá)是否發(fā)生變化，進(jìn)而確定有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)對(duì)胰島素抵抗大鼠心肌脂質(zhì)代謝是否產(chǎn)生影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 PPARγ抗體(SC-1984，美國(guó)Santa Cruz公司);山羊抗兔 IgG/辣根過氧化物酶(HRP)(碧云天生物技術(shù)研究所);β-actin(碧云天生物技術(shù)研究所);RIPA蛋白裂解液(P0013B，碧云天生物技術(shù)研究所);DSPT-202動(dòng)物跑臺(tái)(杭州段氏制造);電泳儀(美國(guó)Hoefer公司);轉(zhuǎn)膜儀(北京百晶生物技術(shù)限公司)等。所有實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)流程在上海體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)健身科技省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)動(dòng)分子中心操作進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠215只，7周齡，體重206～257 g。大鼠購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，批準(zhǔn)號(hào)為〔準(zhǔn) SCXK(滬)2003-0002〕。清潔級(jí)飼養(yǎng)室:5只/籠進(jìn)行分組，光照12 h，天黑前投食，自由飲水;環(huán)境溫度為22±2℃，相對(duì)濕度55.6%±4%。大鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，分為安靜對(duì)照組(CON)15只，胰島素抵抗模型組(MIR)200只。造膜成功后，MIR組分為高脂膳食安靜對(duì)照組(DIO)15只、高脂膳食運(yùn)動(dòng)組(DE)15只、正常膳食安靜對(duì)照組(NOR)15只、正常膳食運(yùn)動(dòng)組(NE)15只。CON組無任何干預(yù);DIO組僅繼續(xù)高脂喂養(yǎng);DE組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)8 w，同時(shí)進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng);NOR組改為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng);NE組改為基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8 w，同時(shí)進(jìn)行中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.3 模型建立及運(yùn)動(dòng)方案 基礎(chǔ)飼料:蛋白質(zhì)22.0%，脂肪5.2%，碳水化合物52.0%，其他20.8%。高脂飼料:在上述飼料基礎(chǔ)上，添加 10.0%豬油，15.0%蔗糖，0.2%膽固醇，0.2%蛋黃?；A(chǔ)飼料及高脂飼料由中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.3.1 MIR建立 CON和MIR組不限食量飼養(yǎng)。CON組基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)8 w;MIR組高脂飼料喂養(yǎng)8 w，隨后進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn):大鼠空腹12 h，眼眶靜脈取血以利舒坦血糖儀及試紙測(cè)即時(shí)空腹血糖(FBG)，同時(shí)留取空腹靜脈血 0．5 ml。用 50%葡萄糖灌胃(2 g/kg)。于糖負(fù)荷后15、30、60和 120 min測(cè)即時(shí)血糖，并于每一時(shí)間點(diǎn)取血 0．5 ml，37℃ 靜置 10～20 min，3 000 r/min 離心 5min，分離血清，－20℃保存，待測(cè)，并根據(jù)公式，計(jì)算葡萄糖曲線下面積(AUCg)和胰島素曲線下面積(AUCi)。AUCg=1/2×(0 min+15 min)×0．25+1/2×(15 min+30 min)×0．25+1/2×(60 min+30 min)×0．5+1/2×(60 min+120 min)×1;AUCi=1/2×(0 min+15 min)×0．25+1/2×(15 min+30 min)×0．25+1/2×(60 min+30 min)×0．5+1/2×(60 min+120 min)×1。檢驗(yàn)建模是否成功，測(cè)定FBG和空腹胰島素(FIN)，并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。MIR組ISI顯著低于CON組，表明模型建立成功。ISI=In〔1/(FBS×FIN)〕〔5〕。胰島素為目前已知的唯一的降糖激素，其降糖作用發(fā)揮主要依賴于機(jī)體胰島素敏感性達(dá)到某一穩(wěn)定的平衡，血漿胰島素及其組織敏感性都與血糖呈負(fù)相關(guān)，該公式可用于同一種群。模型建成后，將MIR組按體重排序，選取上游30%大鼠進(jìn)行后續(xù)研究〔6〕。

1.3.2 運(yùn)動(dòng)方案 開始時(shí)連續(xù)運(yùn)動(dòng)9 d，第1天跑速10 m/min，持續(xù)時(shí)間 20 min，以后隔日增加速度2 m/min，持續(xù)時(shí)間增加 10 min，第 9天起跑速達(dá)18 m/min，持續(xù)時(shí)間達(dá)60 min，跑臺(tái)坡度為5%，維持此強(qiáng)度，每周運(yùn)動(dòng)5 d，持續(xù)4 w;在第5～8周將跑速調(diào)節(jié)到 20 m/min，其余和前 4 w 相同〔7〕。

1.4 取材及實(shí)驗(yàn)方法 末次運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后，于第2天早晨用水合氯醛腹腔麻醉各組大鼠，取心臟，置于－80℃冰箱，冰凍處理。Western印跡半定量測(cè)定 PPARγ表達(dá)。

1.5 Western印跡 取200 mg心肌，加入1 ml RIPA裂解液和蛋白酶及磷酸酶抑制劑，置于冰上，進(jìn)行玻璃勻漿器研磨;4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，保存于－20℃冰箱，待用。取適量蛋白與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液(2×)，1∶1混勻，沸水煮 6～8 min，冷卻后保存于－20℃。取蛋白樣品60 μg上樣，60 V電壓，在5%濃縮膠中濃縮約1.5 h;80 V電壓，在12%分離膠中分離約2.5 h;以120 V電壓轉(zhuǎn)膜約2 h。封閉:5%脫脂奶粉中4℃過夜。將NC膜置于一抗(PPARγ抗體:1∶500;β-actin:1∶1 000)中，4℃過夜;次日 TBST 洗滌 5×5 min，敷二抗(山羊抗兔IgG/HRP:1∶1 000)。室溫下?lián)u床2 h;電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光，暗室顯影，灰度分析。

1.6 數(shù)據(jù)處理 Quantity One軟件讀取蛋白條帶的積分灰度值，Western印跡結(jié)果用目的蛋白積分灰度值與內(nèi)參蛋白積分灰度值的比值表示。GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計(jì)及圖像生成，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胰島素抵抗大鼠建模成功 兩組葡萄糖吸收符合正常代謝過程，即均先升高然后逐漸下降。MIR組血糖上升幅度顯著高于CON組(P＜0.05，P＜0.01)。MIR組血漿胰島素濃度顯著高于CON組(P＜0.01)。CON組與MIR組FBG差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，F(xiàn)IN和ISI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明建模成功，見表 1，表 2。

表1 CON組和MIR組血糖及胰島素濃度比較(，n=8)

表1 CON組和MIR組血糖及胰島素濃度比較(，n=8)

與 CON 組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01，同表 2

組別 血糖(mmol/L)胰島素(μU/ml)0 min 15 min 30 min 60 min 120 min 0 min 15 min 30 min 60 min 120 min CON 組 5.25±0.11 7.10±1.15 9.27±0.66 9.83±0.81 7.72±0.88 26.76±5.90 58.98±10.63 46.08±12.22 28.26±1.38 26.12±1.58 MIR 組 5.47±0.77 8.94±1.522) 10.48±0.792) 12.10±2.302) 10.36±2.801) 77.56±7.291)127.09±15.511)92.51±6.471) 87.71±8.851)60.74±10.461)

表2 CON組和MIR組FBG、FIN、ISI比較(，n=8)

表2 CON組和MIR組FBG、FIN、ISI比較(，n=8)

組別 n FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI AUCg AUCi CON 組 15 5.25±0.15 26.76±6.69 －4.92±0.22 17.14±1.08 69.62±7.66 MIR 組 60 5.47±0.77 77.56±7.291) －6.04±0.191) 21.10±3.422) 172.31±9.132)

2.2 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組大鼠體重的變 化 與CON組相比，NE組NOR組、DIO組和DE組體重均顯著升高(P＜0.05)。與DIO組相比，從第2周干預(yù)起，NOR組和DE組體重均顯著降低(P＜0.05);從第3周干預(yù)起，NE組顯著性低于DIO組(P＜0.05)。見表3。

表3 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后大鼠體重的變化(，g，n=8)

表3 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后大鼠體重的變化(，g，n=8)

與CON組比較:1)P＜0.05;與DIO組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 第1周 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周 第7周 第8周CON 組 484±28 496±25 504±23 508±24 512±23 515±22 519±22 522±23 NE 組 577±331) 579±321) 571±321)2) 565±301)2) 557±301)2) 552±291)2) 546±291)2) 540±32)NOR 組 575±231) 563±261)2) 558±271)2) 561±241)2) 564±241)2) 566±241)2) 568±271)2) 571±271)2)DIO 組 586±271) 609±221) 623±191) 637±161) 644±151) 653±151) 662±181) 670±171)DE 組 571±291) 574±291)2) 574±281)2) 570±281)2) 568±281)2) 566±261)2) 563±261)2) 561±231)2)

2.3 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組FBG、FIN、ISI比較 5組FBG水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與CON組相比，DIO組FIN、ISI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與DIO組相比，DE組、NE組和NOR組FIN、ISI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組FBG、FIN、ISI表達(dá)比較(，n=8)

表4 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組FBG、FIN、ISI表達(dá)比較(，n=8)

組別 FBG(mmol/L) FIN(μU/ml) ISI CON 組 5.52±0.50 23.77±5.03 －4.85±0.17 DIO 組 6.06±1.07 131.60±22.881) －6.66±0.271)DE 組 5.62±0.33 41.45±16.402) －5.38±0.472)NOR組 5.54±0.59 29.86±9.722) －5.06±0.402)NE 組 5.56±0.50 35.85±5.222) －5.28±0.202)

2.4 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組心臟重量(HW)和心臟重量指數(shù)(HW/BW)比較 NOR組HW明顯高于CON組(P＜0.05);DIO組明顯高于DE組、NE組和NOR組(P＜0.05)，且顯著高于CON組(P＜0.01)。NE組HW/BW顯著高于CON組(P＜0.01)，NOR組和NE組顯著高于DIO組(P＜0.01)。見表5。

2.5 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組心肌PPAR-γ比較 DE組和NE組心肌PPARγ表達(dá)量(0.87±0.09、0.88±0.09)顯著高于 CON 組(0.69±0.03，P＜0.05)，DIO組(0.53±0.07)顯著低于CON組(P＜0.05);DE組和NE組顯著性高于DIO組(P＜0.05)。NOR組為0.60±0.09。見圖 1。

表5 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組大鼠HW和HW/BW的變化(，n=8)

表5 8 w有氧運(yùn)動(dòng)及膳食干預(yù)后各組大鼠HW和HW/BW的變化(，n=8)

與CON 組相比:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 DIO 組相比:3)P＜0.05

組別 HW(mg) HW/BW(mg/g)CON 1.24±0.08 2.5±0.183 DIO 1.53±0.231) 2.3±0.377 DE 1.24±0.103) 2.5±0.210 NOR 1.39±0.272)3) 2.8±0.7263)NE 1.28±0.123) 2.6±0.2262)3)

3 討論

圖1 心肌PPAR-γ Western印跡

國(guó)外研究〔8，9〕表明，高脂飼料誘導(dǎo)所致的肥胖動(dòng)物模型，符合人類肥胖-胰島素抵抗實(shí)際特征，因此本實(shí)驗(yàn)選擇高脂飼料喂養(yǎng)進(jìn)行胰島素抵抗模型構(gòu)造。

誘發(fā)心臟功能障礙的一個(gè)重要因素是心肌胰島素抵抗，心肌胰島素抵抗重要特征之一即心肌細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)代謝持續(xù)儲(chǔ)積〔10〕，心肌脂代謝出現(xiàn)紊亂。PPARγ表達(dá)于心肌細(xì)胞中，可調(diào)控脂肪細(xì)胞分化基因表達(dá)，提高細(xì)胞質(zhì)脂解能力，增強(qiáng)脂肪酸向細(xì)胞運(yùn)輸能力，影響細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性，從而影響糖脂代謝，改善胰島素抵抗。Weismann等〔11〕通過敲除Trib3基因大鼠的胰島素抵抗模型，觀察PPARγ對(duì)大鼠胰島素敏感性調(diào)節(jié)狀況，發(fā)現(xiàn)大鼠的胰島素敏感性調(diào)節(jié)主要依靠PPARγ進(jìn)行，由此可見，PPARγ與胰島素抵抗疾病的發(fā)生有重要關(guān)系。Sone等〔12〕以138名日本男性為研究對(duì)象，根據(jù)其是否具有習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)，檢查其血脂變化，發(fā)現(xiàn)具有習(xí)慣性運(yùn)動(dòng)男性的血脂通過PPARγ調(diào)節(jié)，其血脂具有顯著改善。

適度有氧運(yùn)動(dòng)可降低體重，上調(diào)脂代謝，減輕胰島素抵抗。Marinho等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)任何強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)都可以有效增強(qiáng)小鼠胰島素敏感性。Fedewa等〔14〕對(duì)運(yùn)動(dòng)是否能夠改善青少年胰島素抵抗，進(jìn)行Meta分析，結(jié)果表明小強(qiáng)度到中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)可以有效改善其胰島素抵抗?fàn)顩r。一份2003～2004年度美國(guó)國(guó)民健康與營(yíng)養(yǎng)調(diào)查報(bào)告〔15〕顯示，每天適量的身體運(yùn)動(dòng)可有效降低胰島素抵抗程度，對(duì)于改善血糖代謝，維持血糖穩(wěn)定而言，是一個(gè)重要的決定因素。Ruschke等〔16〕研究中，對(duì)153例患者進(jìn)行為期4 w的加強(qiáng)性運(yùn)動(dòng)，發(fā)現(xiàn)患者的PPARγ與胰島素抵抗有相關(guān)性，且其 PPARγ mRNA表達(dá)量增加，有利于提高患者胰島素敏感性?？傊葝u素抵抗患者保持適當(dāng)?shù)挠醒踹\(yùn)動(dòng)即可改善其胰島素抵抗癥狀。

有氧運(yùn)動(dòng)除了可改善胰島素抵抗癥狀之外，也有學(xué)者從膳食方面對(duì)胰島素抵抗的改善進(jìn)行了研究。研究發(fā)現(xiàn)為期6個(gè)月的低脂飲食可以有效改善胰島素抵抗現(xiàn)象〔17〕。另外，胰島素抵抗的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)與維生素D攝入量呈顯著負(fù)相關(guān)〔18〕，表明在胰島素抵抗患者的膳食攝入中應(yīng)增加維生素D的含量。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)增加不飽和脂肪酸和膳食纖維的攝入量，可以大幅度減少青少年日后胰島素抵抗疾病的發(fā)生〔19〕。

由于有氧運(yùn)動(dòng)和膳食改變可改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，研究者將運(yùn)動(dòng)和飲食限制結(jié)合起來對(duì)具有胰島素抵抗的肥胖大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)合改善了大鼠肥胖所致的炎癥和胰島素抵抗所致的血管舒張〔20〕。但是關(guān)于兩者結(jié)合干預(yù)胰島素抵抗的研究并不多見，且對(duì)有氧運(yùn)動(dòng)、膳食改變和有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合膳食改變這三種干預(yù)胰島素抵抗的方式間并未有比較性的研究。本研究結(jié)果表明有氧運(yùn)動(dòng)結(jié)合膳食干預(yù)對(duì)于大鼠體重控制的效果最為明顯。FIN、ISI和PPARγ都有效反映了機(jī)體的糖脂代謝和胰島素抵抗程度。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)和膳食干預(yù)均有效地不同程度增加大鼠心肌PPARγ表達(dá)，減輕胰島素抵抗，而有氧運(yùn)動(dòng)與膳食干預(yù)相比，更有效地增加大鼠心肌PPARγ表達(dá)，改善了胰島素抵抗，而兩者疊加進(jìn)行干預(yù)，則效果更顯著。

綜上，PPARγ在體內(nèi)糖脂代謝中作用復(fù)雜，有氧運(yùn)動(dòng)或(和)膳食干預(yù)如何影響PPARγ表達(dá)還需進(jìn)一步研究。目前針對(duì)PPARγ如何改善胰島素抵抗中的脂質(zhì)代謝的機(jī)制仍存在一定爭(zhēng)議，仍需大量實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。