陳建榮 朱光輝

上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院普外科1(201499) 上海市公共衛(wèi)生臨床中心普外科2

背景：CXCR4在腫瘤細胞中廣泛表達，參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。RNA干擾技術(shù)可有效降低或關(guān)閉基因的表達，從不同水平阻斷腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。目的：研究胃癌組織中CXCR4 mRNA和蛋白表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，并探討siRNA沉默CXCR4表達對胃癌生物學(xué)行為的影響。方法：選取86例胃癌及其癌旁正常黏膜組織，應(yīng)用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測CXCR4 mRNA和蛋白表達，并分析其與臨床病理特征的關(guān)系。構(gòu)建CXCR4干擾RNA質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)染胃癌MKN45細胞。應(yīng)用MTT法、Transwell法、流式細胞術(shù)分別評估胃癌細胞增殖、遷移和侵襲、凋亡能力。結(jié)果：胃癌組織中CXCR4 mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)，且其表達與TNM分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。與陰性對照組相比，siRNA轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24、48、72 h后MKN45細胞增殖力均顯著降低(P<0.05)，遷移率和侵襲率均顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：CXCR4在胃癌發(fā)展過程中具有重要作用；以siRNA沉默CXCR4基因后，可顯著抑制MKN45細胞增殖，抑制體外細胞遷移和侵襲，促進細胞凋亡，從而為胃癌的治療提供新策略。

全球范圍內(nèi)胃癌的發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤前列，盡管醫(yī)療技術(shù)不斷進步，但胃癌致死率仍居高不下，已成為嚴重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。目前趨化因子及其受體在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的機制已成為目前研究的熱點。趨化因子受體4(CXCR4)屬于趨化因子受體CXC亞家族，通過與基質(zhì)細胞衍生因子-1(SDF-1)結(jié)合啟動下游信號通路[3]。CXCR4在食管癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤中高表達，可通過各種信號通路調(diào)控細胞增殖和凋亡，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4-6]。但CXCR4在胃癌中的發(fā)病機制目前尚不十分清楚。本研究通過觀察CXCR4在胃癌及其癌旁組織中的表達，分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，并探討siRNA沉默CXCR4基因?qū)ξ赴┘毎闙KN45增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，旨在探討CXCR4在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，從而為臨床應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)治療胃癌提供新的思路。

材料與方法

一、臨床對象

選取2013年7月—2013年12月上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院腹外科86例胃癌住院患者，診斷經(jīng)術(shù)后病理檢查確診。其中男51例，女35例，年齡29～69歲，平均年齡(37.24±3.21)歲。腫瘤TNM分期和組織病理學(xué)分型依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的標準[7]。同時選取相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣>5 cm 的正常胃黏膜組織)作為對照，取得標本后迅速放入液氮保存。所有患者臨床病例資料完整，術(shù)前均未接受過放療、化療、靶向和生物治療。本研究方案由上海市奉賢區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會批準通過。所有患者及其家屬均取得知情同意。

二、研究方法

1. RT-PCR法檢測CXCR4 mRNA表達：取適量胃癌及其相應(yīng)癌旁正常組織，采用mRNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京義翹神州科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈，行熒光定量PCR(Biomics Biotech)，PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，以2-ΔΔCt法計算CXCR4 mRNA相對表達量。

2. 蛋白質(zhì)印跡法檢測CXCR4蛋白表達：分別收集和裂解胃癌及其相應(yīng)癌旁組織中的細胞，BCA法定量蛋白濃度(試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司)，行SDS-PAGE 凝膠電泳，以β-actin作為內(nèi)參，加入一抗、二抗(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，工作濃度分別為1∶10 000、1∶5 000)。ECL顯影(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

3. CXCR4-siRNA真核表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染：人胃癌細胞株MKN45購自上海慧穎生物科技有限公司。CXCR4-siRNA片段由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游：5’-ATG CAA GGC AGT CCA TGT CAT-3’；下游：5’-ATG AAT GTC CAC CTC GCT TT-3’。插入siRNA表達質(zhì)粒 pSilencer3.1-HIneo(由北京義翹神州科技有限公司構(gòu)建)，轉(zhuǎn)染大腸桿菌，大量擴增提純后，轉(zhuǎn)染胃癌細胞株MKN45(LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購自Invitrogen公司)，按照試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染72 h后，將保存正確的單克隆菌液接種于G418培養(yǎng)液(上海翊圣生物科技有限公司)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。設(shè)立陰性對照組片段，采用無關(guān)序列RNA進行轉(zhuǎn)染。

4. MTT法檢測細胞體外增殖能力：收集轉(zhuǎn)染后的CXCR4-siRNA細胞，分別接種于96孔板中，使用逆向轉(zhuǎn)染的方法同步轉(zhuǎn)染CXCR4和陰性對照，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，每孔加入50 μL MTT溶液(購自Sigma公司，5 mg/mL)，置入孵箱溫育3 h后吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，上平板床搖勻。于490 nm 波長處，應(yīng)用酶標儀測定各孔吸光度(A)值，細胞抑制率(%)=(1-siRNA轉(zhuǎn)染組A值/陰性對照組A值)×100%，每組設(shè)立6個復(fù)孔，取均值。

5. Transwell體外趨化侵襲實驗：將轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后的細胞制成單細胞懸液，取200 μL稀釋好的單細胞懸液加入未鋪膠的Transwell小室(Corning公司)的上室內(nèi)，將600 μL含100 ng/mL SDF-1(美國PeproTech公司)的細胞培養(yǎng)液加入小室的下室內(nèi)。置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，評估細胞遷移情況。遷移率(%)=處理組細胞數(shù)/陰性對照組細胞數(shù)×100%。

將轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后的單細胞懸液細胞密度設(shè)為1×105，在Transwell小室的上室鋪好Martigel基質(zhì)膠。倒置顯微鏡下隨機計數(shù)6個視野，評估細胞侵襲情況。侵襲率(%)=處理組細胞數(shù)/陰性對照組細胞數(shù)×100%。

6. 細胞凋亡的檢測：分別收集轉(zhuǎn)染組和對照組MKN45細胞。根據(jù)Annexin FITC/PI雙標記試劑盒說明書進行操作。APOI(凋亡細胞數(shù)/細胞計數(shù)總數(shù))表示細胞凋亡情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、CXCR4 mRNA和蛋白表達

胃癌組織中CXCR4 mRNA和蛋白表達均明顯高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1、圖1)。

組別例數(shù)mRNA表達蛋白表達胃癌組織861.08±0.12?0.61±0.05?癌旁正常組織860.35±0.060.33±0.02

*與癌旁正常組織比較，P<0.05

1 Da=0.992 1 u

二、CXCR4 mRNA和蛋白表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

胃癌患者的性別、年齡、腫瘤大小與CXCR4 mRNA和蛋白表達均無關(guān)(P>0.05)；隨著臨床TNM分期升高、腫瘤分化程度降低，CXCR4 mRNA和蛋白表達明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織中CXCR4 mRNA和蛋白表達明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

三、MKN45細胞增殖能力的比較

轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后，與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)24、48、72 h的細胞增殖能力顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與培養(yǎng)0 h相比，siRNA轉(zhuǎn)染組和陰性對照組培養(yǎng)24、 48、 72 h的細胞增殖能力均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

四、MKN45細胞遷移、侵襲能力的比較

與陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后MKN45細胞的遷移率和侵襲率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表4、圖2～3)。

五、細胞凋亡

MKN45細胞轉(zhuǎn)染CXCR4-siRNA后，細胞凋亡較轉(zhuǎn)染前明顯增加，而陰性對照組轉(zhuǎn)染后細胞凋亡無明顯變化(P>0.05)，且siRNA轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率明顯高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

臨床病理特征例數(shù)CXCR4mRNA表達P值CXCR4蛋白表達P值性別>0.05>0.05 男511.07±0.070.66±0.04 女351.11±0.090.59±0.03年齡>0.05>0.05 <60歲381.05±0.090.60±0.03 ≥60歲481.10±0.080.63±0.04腫瘤大小>0.05>0.05 <5 cm381.06±0.090.63±0.05 ≥5 cm481.10±1.020.59±0.03TNM分期<0.05<0.05 Ⅰ+Ⅱ360.89±0.060.51±0.04 Ⅲ+Ⅳ501.23±0.130.68±0.06分化程度<0.05<0.05 中-高分化450.89±0.070.52±0.03 低分化411.38±0.130.78±0.04淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移<0.05<0.05 無450.93±0.080.44±0.03 有411.33±0.090.76±0.06

表3 兩組培養(yǎng)24、48、72 h后MKN45細胞增殖能力的比較

*與同組0 h比較，P<0.05；#與同時間點陰性對照組比較，P<0.05

表4 兩組細胞遷移和侵襲能力的比較(%)

*與陰性對照組比較，P<0.05

圖2陰性對照組MKN45細胞遷移和侵襲能力(Trans-well法)

圖3siRNA轉(zhuǎn)染組MKN45細胞遷移和侵襲能力(Trans-well法)

圖4 流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染48 h后MKN45細胞凋亡情況

討 論

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織中CXCR4 mRNA和蛋白表達明顯高于相應(yīng)癌旁正常組織，其表達與腫瘤TNM分期、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，即腫瘤惡性程度和臨床分期越高，CXCR4 mRNA和蛋白表達水平越高，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織CXCR4 mRNA和蛋白表達明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，提示CXCR4可能在一定程度上調(diào)控癌細胞行為，抑制腫瘤細胞凋亡，從而促進胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。

胃癌的發(fā)生是一個多基因、多階段、多途徑共同作用的結(jié)果，細胞有絲分裂和凋亡、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、血管內(nèi)皮細胞增殖和侵襲、耐藥相關(guān)基因表達異常與胃癌的發(fā)生有關(guān)。目前我國發(fā)現(xiàn)的約90%的胃癌屬于進展期[8]，惡性腫瘤的高度侵襲性和早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移是絕大多數(shù)胃癌患者死亡的原因。

RNA干擾技術(shù)可有效誘導(dǎo)基因沉默，改變與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達，特異性阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移，為研究基因調(diào)控的一種新手段[9]。相關(guān)研究[10]表明，CXCR4在胃癌組織中選擇性高表達，并與臨床分期、病理程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，推測CXCR4在胃癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但具體機制還有待進一步研究。據(jù)文獻報道，CXCR4有促進腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用[11]。為進一步研究CXCR4是否介導(dǎo)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，本研究人工合成CXCR4-siRNA片段，以siRNA靶向沉默CXCR4基因并轉(zhuǎn)染胃癌細胞MKN45，結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，沉默CXCR4基因可明顯抑制MKN45細胞增殖，抑制細胞遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。研究[12]顯示，CXCR4-siRNA能減緩G0/G1期細胞進入增殖周期，抑制細胞分裂增殖，促進細胞凋亡。國內(nèi)有研究[13]顯示，腺病毒表達載體通過基因沉默機制抑制CXCR4基因的表達，能有效抑制胃癌細胞SGC7901侵襲和增殖能力，在一定程度上抑制胃癌細胞的轉(zhuǎn)移。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)CXCR4在胃癌組織中的高表達可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移進程，成功構(gòu)建了CXCR4-siRNA真核表達載體并轉(zhuǎn)染胃癌細胞株MKN45，沉默CXCR4基因可抑制胃癌細胞MKN45增殖、侵襲能力，并誘導(dǎo)其凋亡，有望為胃癌的治療提供新的策略和靶點。但本實驗為體外實驗驗證沉默CXCR4基因?qū)刂莆赴┘毎霓D(zhuǎn)移，期待后續(xù)研究模擬人體內(nèi)環(huán)境行進一步探討。