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上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院消化內科 上海市消化疾病研究所1(200001)上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科2

背景：CBX3屬于異染色質蛋白家族成員之一，近年研究發(fā)現CBX3與肺癌、骨肉瘤、胃癌等多種人類癌癥密切相關。目的：探討CBX3在結直腸癌中的表達及其臨床意義，并探索可能的作用機制。方法：選取2011年6月—2012年6月上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院30例結直腸癌組織及其相應癌旁正常組織。以實時定量PCR和免疫組化法分別檢測CBX3 mRNA和蛋白表達。將CBX3過表達質粒和CBX3 siRNA轉染人結直腸癌細胞株RKO，以CCK-8法檢測細胞增殖，蛋白質印跡法檢測CBX3、p53蛋白表達。結果：結直腸癌組織中CBX3 mRNA和蛋白表達均顯著高于相應癌旁正常組織，且CBX3蛋白表達與腫瘤大小(P=0.025)、淋巴結轉移(P=0.013)和TNM分期(P=0.020)相關。過表達CBX3可有效上調RKO細胞中CBX3 mRNA和蛋白表達，促進細胞增殖，同時上調p53蛋白表達；敲低CBX3可有效下調CBX3 mRNA和蛋白表達，抑制細胞增殖，同時下調p53蛋白表達。結論：CBX3可能通過影響p53表達來促進結直腸癌細胞增殖，進而影響結直腸癌疾病進程，提示CBX3有望成為診斷和治療結直腸癌的新靶點。

結直腸癌是目前全球第三大常見的惡性腫瘤，2012年全球結直腸癌新發(fā)病例超過136萬，位居所有惡性腫瘤的第3位(其中男性位居第3位，女性位居第2位)，死亡人數超過69萬，位居第4位(其中男性位居第4位，女性位居第3位)[1]。隨著生活水平的提高和膳食結構的改變，我國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年上升的趨勢[2]。對2012年全國惡性腫瘤發(fā)病和死亡的分析發(fā)現，結直腸癌發(fā)病率位居第4位(其中男性位居第5位，女性位居第3位)，死亡率位居第5位(其中男性位居第5位，女性位居第4位)[3]。結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展涉及多種基因調控失常和信號通路轉導異常，其機制一直是研究的熱點，對結直腸癌的治療和預后具有重要的指導意義。

染色盒3(chromobox 3, CBX3)屬于異染色質蛋白家族成員之一，其染色質結構域能在組蛋白甲基轉移酶uv339H1的協(xié)助下識別甲基化組蛋白H3K9，從而調控基因的表達[4-6]。CBX3與甲基化H3K9結合能招募各種協(xié)同因子參與細胞內多種生物學過程，包括端粒代謝、DNA損傷修復、RNA剪接、轉錄延伸、轉錄抑制和激活等[7-10]。近年研究發(fā)現CBX3與肺癌、舌癌、骨肉瘤、前列腺癌等多種人類癌癥密切相關[11-14]，但具體的分子機制目前尚不清楚。

p53是迄今發(fā)現與人類腫瘤相關性最高也是最重要的基因。野生型p53是一種抑癌基因，編碼的p53蛋白是一種轉錄因子，可控制細胞周期的啟動，對細胞分裂起減慢或監(jiān)視的作用，如細胞受損而又未得到修復，p53將誘導細胞凋亡[15-18]。

本研究通過檢測結直腸癌患者中CBX3表達，并以CBX3過表達質粒和siRNA轉染人結直腸癌細胞株RKO(RKO為p53野生型細胞株)，檢測細胞增殖情況以及p53蛋白表達，旨在探討CBX3在結直腸癌中的可能作用機制，從而為結直腸癌的診斷和治療提供一定的理論依據。

材料與方法

一、研究對象

選取2011年6月—2012年6月上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院30例結直腸癌患者，診斷經術后病理檢查證實。同時選取距病變邊緣5 cm以上的癌旁組織作為對照。其中男17例，女13例；年齡31～90歲，平均67歲；腫瘤長徑<5 cm者12例，≥5 cm者18例；中-高分化5例，低分化25例；根據美國癌癥聯合委員會(AJCC)TNM分期，Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期10例；浸潤局限于黏膜層或肌層者5例，漿膜或全層者25例；有淋巴結轉移8例，無淋巴結轉移22例；有遠處轉移2例，無遠處轉移28例。入選者住院前未接受過手術、放化療或免疫抑制劑治療。所有入選者均取得知情同意，本研究方案通過上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院倫理委員會的審批。

二、主要儀器和材料

實時熒光定量PCR儀(ABI公司)；RNAiso Plus總RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒和Real-Time PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；CBX3特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(序列見表1)；人結直腸癌細胞株RKO(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CBX3 siRNA(由上海吉瑪制藥技術有限公司構建)(序 列見表1)；FuGENE HD轉染試劑(美國Promega)；DharmaFECT 1轉染試劑(美國GE Healthcare)；CCK-8試劑盒(日本株式會社同仁化學研究所)；RIPA蛋白裂解液(美國Thermo Fisher Scientific)；CBX3抗體(美國Proteintech公司)、p53抗體(美國Santa Cruz公司)、GAPDH抗體(美國Cell Signaling Technology公司)、HRP標記的IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)。

表1 CBX3序列

三、研究方法

1. 實時定量PCR法：取結腸組織充分研磨后裂解細胞，提取RNA，逆轉錄合成cDNA。行實時PCR，具體步驟參照試劑盒說明書進行。以2-△△Ct法計算樣本目的基因mRNA相對表達量，每組設立3個復孔。

2. 免疫組化染色法：將組織切片以3% H2O2處理15 min，消除內源性過氧化物酶活性；以PBS微波加熱修復抗原15 min后自然冷卻至室溫；滴加非免疫性羊血清，室溫封閉30 min；滴加CBX3抗體(工作濃度為1∶200)，4 ℃濕盒過夜后復溫 30 min，PBS漂洗3次；滴加HRP標記的二抗，DAB顯色，蘇木精復染，自然晾干后中性樹膠封片。

結果判斷：光學顯微鏡下，細胞質呈淡黃色或黃褐色顆粒定義為陽性細胞。采用Formwitz半定量積分法。于200倍視野下隨機觀察5個視野，計數陽性細胞，并觀察染色強度。陽性細胞率：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強度：無染色，0分；淡黃色，1分；黃色，2分；黃褐色，3分。兩項評分之積為染色總分：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中等陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。陰性和弱陽性為低表達，中等陽性和強陽性為高表達。采用雙盲法由兩名醫(yī)師獨立評分，不一致時取均值。

3. 細胞培養(yǎng)和轉染：將RKO細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數生長期后，以2×105個/孔的密度接種于6孔板。待細胞貼壁后進行轉染。具體操作步驟參照FuGENE HD和DharmaFECT 1轉染試劑說明書進行，轉染后繼續(xù)孵育24～72 h。

4. 細胞增殖實驗：RKO細胞按2 500個/孔的密度接種于96孔板上，每組設6個復孔，待細胞貼壁后轉染。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后加入CCK-8試劑(以無血清培養(yǎng)基按照1∶10的體積比稀釋)。使用酶標儀讀取450 nm波長處的吸光度(A)值，繪制細胞增殖圖。

5. 蛋白質印跡法：RKO細胞轉染CBX3 siRNA 48～72 h后，收集細胞，以預冷的PBS洗滌，加入蛋白裂解液裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清，BCA法定量蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，行10% SDS-PAGE電泳分離后轉移至NC膜，經5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入CBX3、p53、GAPDH一抗(工作濃度分別為1∶1 000、1∶500、1∶2 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×5次，加入二抗(工作濃度1∶3 000)，常溫孵育1 h。計算目的蛋白的相對表達量。

四、統(tǒng)計學分析

結 果

一、結直腸癌患者中CBX3表達及其與臨床病理特征的關系

在30例結直腸癌患者中，實時定量PCR結果顯示結直腸癌組織中CBX3 mRNA表達顯著高于癌旁正常組織(P<0.001)(圖1A)，免疫組化結果顯示結直腸癌組織中CBX3蛋白表達顯著高于相應癌旁正常組織(P<0.001)(圖1B、圖2)。CBX3蛋白高表達與腫瘤大小(P=0.025)、淋巴結轉移(P=0.013)和TNM分期(P=0.020)相關，而與患者的性別、年齡、分化程度、浸潤深度和遠處轉移無關(P>0.05)(表2)。

二、RKO細胞中CBX3 mRNA和蛋白表達

A：mRNA相對表達量(實時定量PCR法)；B：蛋白表達(免疫組化評分)

表2結直腸癌患者中CBX3蛋白表達與臨床病理特征的關系(n)

臨床病理例數CBX3表達高(n=15)低(n=15)P值性別 男171070.269 女1358年齡(歲) <6513580.269 ≥6517107腫瘤大小(cm) <512390.025 ≥518126分化程度 中-高分化5320.624 低分化251213浸潤深度 T1～T25230.624 T3～T4251312淋巴結轉移 N0228140.013 N1～N2871遠處轉移 M02814141.000 M1211TNM分期 Ⅰ～Ⅱ207130.020 Ⅲ～Ⅳ1082

實時定量PCR結果顯示，以質粒過表達CBX3后，其mRNA表達顯著增高；以siRNA敲低CBX3后， 其mRNA表達顯著降低(圖3)。蛋白質印跡法亦顯示過表達或敲低CBX3表達后，CBX3蛋白表達顯著增高或降低(圖4)。提示過表達質粒和siRNA可有效調控RKO細胞中CBX3 mRNA和蛋白表達。

1 Da=0.992 1 u

圖4過表達和敲低CBX3表達后RKO細胞中CBX3和p53蛋白表達變化(蛋白質印跡法)

三、CBX3對RKO細胞增殖的影響

與對照組相比，過表達CBX3可促進RKO細胞增殖，敲低CBX3表達可抑制RKO細胞增殖，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖5)。說明CBX3能影響結直腸癌細胞的增殖能力。

四、CBX3對p53表達的影響

蛋白質印跡法結果顯示，轉染72 h后，過表達CBX3的RKO細胞中p53蛋白表達較對照組顯著降低；敲低CBX3表達后，RKO細胞中p53蛋白表達較對照組顯著升高(圖4)。說明CBX3對p53蛋白表達有一定的調控作用。

討 論

作為異染色質蛋白家族成員，CBX3能結合基因啟動子區(qū)2甲基化或3甲基化的H3K9，從而起沉默基因的作用[19]。有文獻報道CBX3可負調控p53下游的p21基因，從而促進腫瘤生長[20]。目前尚不清楚CBX3對p53是否具有調控作用。p53自1979年被首次報道以來，已被認為是最重要的腫瘤抑制基因之一，對細胞生長、凋亡和 DNA 修復起調控作用[21]。但起初p53一度被認為是癌基因，隨著研究的不斷深入，發(fā)現其在人類50%以上的腫瘤組織中均發(fā)生突變，突變后由于其空間構象發(fā)生了改變，失去了應有的抑癌功能，故由抑癌基因轉變?yōu)榘┗騕22-24]。有鑒于此，本研究選用RKO細胞株進行實驗，其是p53野生型結直腸癌細胞株。

圖2 結直腸癌和癌旁正常組織中CBX3蛋白表達(免疫組化染色，×200)

圖3 過表達和敲低CBX3表達后RKO細胞中CBX3 mRNA表達變化(實時定量PCR法)

圖5 過表達和敲低CBX3后RKO細胞增殖情況(CCK-8法)

本研究檢測了30例結直腸癌患者中CBX3的表達，發(fā)現癌組織中CBX3 mRNA和蛋白表達均明顯高于癌旁正常組織，且蛋白表達與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期相關(P<0.05)。提示CBX3表達可能與結直腸癌患者的惡性程度有關。但本研究樣本量偏少，可能存在一定的偏倚，未來需行大樣本、多中心臨床研究進一步證實。此外，本研究未對結直腸癌患者的生存情況進行隨訪，因此無法明確CBX3表達能否預測患者的預后以及是否能作為預測預后的獨立影響因素。本研究進一步將CBX3過表達質粒和siRNA轉染人結直腸癌細胞株RKO，發(fā)現其能明顯促進或抑制細胞增殖能力，下調或上調p53蛋白表達，從細胞生物學的角度支持了CBX3表達與腫瘤大小等相關的臨床意義。但本課題尚未進行動物實驗，無法明確體內復雜的微環(huán)境是否會對CBX3的作用產生一定的影響，仍需進一步研究證實。

綜上所述，結直腸癌患者CBX3表達水平升高，且與腫瘤大小、淋巴結轉移和TNM分期相關，可能在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中起有一定的作用。CBX3發(fā)揮作用的機制可能是通過調控野生型p53表達而實現的，因此有望成為診斷和治療結直腸癌的新靶點。