歐陽輝，朱興春，劉濤

(1.川北醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，四川 南充 637000；2.達(dá)州市中心醫(yī)院心內(nèi)科，四川 達(dá)州 635000；3.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院，四川 南充 637000)

代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)是以肥胖、高血壓、血脂及糖代謝異常等多種危險(xiǎn)因素在個(gè)體聚集為特征的一組臨床癥候群，主要以胰島素抵抗為核心[1]。研究報(bào)道[2-3]高脂喂食不僅能誘導(dǎo)大鼠糖、脂代謝紊亂，血漿胰島素濃度升高，與高血壓發(fā)生密切相關(guān)，而與之相對(duì)應(yīng)的高纖維膳食除了能夠調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂，還能顯著降低小鼠高血壓模型的收縮壓和舒張壓[4]，且越來越多的證據(jù)表明高脂喂食是通過改變腸道菌群以誘發(fā)代謝綜合征。

既往研究[5]發(fā)現(xiàn)抗生素主要通過改變腸道菌群以影響機(jī)體糖、脂代謝，口服米諾環(huán)素亦通過調(diào)節(jié)腸道菌群減緩大鼠血壓的升高[6]。最新研究[7]證實(shí)以硫酸慶大霉素為代表的氨基糖苷類抗生素更是在抑制腸道菌群方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。故本研究模擬機(jī)體通過高脂飲食導(dǎo)致代謝綜合征的病理環(huán)境，以探索硫酸慶大霉素灌胃干預(yù)是否亦有類似于米諾環(huán)素緩解大鼠血壓升高的作用以及對(duì)高脂喂食大鼠血糖、血脂、胰島素抵抗和體重的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

多通道鼠尾動(dòng)脈無創(chuàng)血壓儀BP6A、酶標(biāo)儀、離心機(jī)、恒溫水浴箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胰島素ELISA試劑盒購自美國CLOUD-CLONE CORP公司；硫酸慶大霉素購自四川省長征藥業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠37只，8周齡，體質(zhì)量160～200 g，來自川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(川)2013-076]。大鼠每3只或4只一籠，飼養(yǎng)于川北醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室內(nèi)晝夜溫度(26±2)℃，濕度約50%，自由進(jìn)食飲水，12 h明暗周期。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后分為3組，對(duì)照組(n=11)、高脂組(n=13)、慶大霉素組(n=13)。給予對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食，給予高脂組及慶大霉素組高脂飼料喂食，飼料成分見表1。標(biāo)準(zhǔn)飼料中蛋白質(zhì)、脂肪、糖供能比分別為27%、10.5%和62.5%；高脂飼料中蛋白質(zhì)、脂肪、糖供能比分別為17.5%、42.5%和40%。第5周開始每周采用無創(chuàng)尾動(dòng)脈測(cè)血壓法監(jiān)測(cè)大鼠血壓，第9周開始慶大霉素組按照硫酸慶大霉素7.2 mg/(kg·d)的標(biāo)準(zhǔn)[8]給予灌胃干預(yù)，高脂組及對(duì)照組給予等體積生理鹽水灌胃。第13周末處死大鼠，收集標(biāo)本。

表1 大鼠飼料成份表(%)

1.4 大鼠一般情況觀察及體質(zhì)量監(jiān)測(cè)

觀察大鼠毛發(fā)、食欲、排泄物，行為狀態(tài)及死亡情況，每周稱體質(zhì)量。

1.5 無創(chuàng)血壓監(jiān)測(cè)

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，測(cè)得的血壓值作為基線水平。每周對(duì)大鼠進(jìn)行束縛實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，減小后續(xù)血壓監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激反應(yīng)對(duì)血壓的干擾。第5周開始，應(yīng)用BP6A動(dòng)脈無創(chuàng)血壓儀尾套法測(cè)量尾動(dòng)脈血壓。將清醒大鼠放入配套的大鼠籠，每次將3只大鼠放入無創(chuàng)血壓保溫箱中，溫度調(diào)至37 ℃底板開始加熱，點(diǎn)擊自檢按鈕，排除漏氣后可使用。依次將阻斷器、傳感器套于大鼠距尾根部較近處，當(dāng)電腦顯示屏中基線出現(xiàn)穩(wěn)定均勻的鋸齒脈搏波時(shí)，說明此時(shí)探測(cè)到大鼠脈搏且大鼠處于安靜狀態(tài)，給大鼠尾部阻斷氣囊充氣加壓，當(dāng)阻斷器開始放氣減壓至脈搏波剛開始出現(xiàn)時(shí)記錄為收縮壓，繼續(xù)減壓會(huì)出現(xiàn)一個(gè)波峰，在波峰處則記錄為舒張壓，再繼續(xù)減壓隨及可出現(xiàn)大鼠平均動(dòng)脈壓。記錄血壓的變化規(guī)律每只大鼠連續(xù)測(cè)定3～5次，取其大鼠安靜狀態(tài)下的血壓值，每周測(cè)1次。

1.6 標(biāo)本收集

第13周末，以2.5%戊巴比妥鈉注射液50 mg/kg體重腹腔注射麻醉。大鼠固定、皮膚消毒完畢，依次剖開腹、胸腔，采集4 mL心臟血至普通肝素采血管，1 000 g離心15 min，取血漿，置于-80 ℃保存。

1.7 血生化指標(biāo)、胰島素檢測(cè)及胰島素抵抗指數(shù)計(jì)算

采用自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇(TC)，總甘油三酯(TG)，低密度脂蛋白(LDL-C)，高密度脂蛋白(HDL-C)，血糖濃度；空腹胰島素采用ELISA試劑盒測(cè)定。計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistenceindex,HOMA-IR)，方法：HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5 。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況、體質(zhì)量變化及生存分析

喂養(yǎng)過程中，對(duì)照組大鼠皮毛緊密、色白、有光澤、活潑、飲食正常；高脂組大鼠隨著喂養(yǎng)時(shí)間延長逐漸出現(xiàn)皮毛松軟變黃、色澤暗淡，喜靜臥，通過觀察每日剩余飼料情況發(fā)現(xiàn)高脂組大鼠每日進(jìn)食量較正常組減少，大便較軟且臭；慶大霉素組大鼠與高脂組比較毛色及光澤度較好、進(jìn)食量基本相同，個(gè)別大鼠大便略軟，慶大霉素組大鼠死亡3只，死亡后立即解剖大鼠可見肺部嚴(yán)重感染灶，切面可見大量膿性分泌物，推測(cè)大鼠死于嚴(yán)重感染(圖1)。高脂喂食組由于灌胃時(shí)操作不當(dāng)窒息死亡1只。共死亡4只大鼠，死亡率為10.8%。

對(duì)不同組大鼠行體質(zhì)量監(jiān)測(cè)，重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果示：Mauchly的球形對(duì)稱檢驗(yàn)P<0.05，認(rèn)為數(shù)據(jù)不滿足對(duì)稱條件，結(jié)果需校正；Greenhouse-Geisser主體內(nèi)效應(yīng)的檢驗(yàn)，F(xiàn)=263.28，P<0.05；時(shí)間與干預(yù)方法的交互作用，F(xiàn)=1.848，P<0.05；不同干預(yù)組間效應(yīng)檢驗(yàn)，F(xiàn)=2.668，P>0.05，可以認(rèn)為3組不同的干預(yù)方法對(duì)大鼠體質(zhì)量影響無差異。大鼠體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)照組(410.09±47.35)g、高脂組(409.08±47.25)g、慶大霉素組(404.8±42.58)g，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

2.2 3組大鼠收縮壓變化

每周監(jiān)測(cè)3組大鼠收縮壓，行重復(fù)測(cè)量方差分析，3組大鼠收縮壓變化與比較結(jié)果見表2。

表2 3組大鼠收縮壓變化

*P<0.05，與對(duì)照組組比較；△P<0.05，與高脂組組比較。

2.3 3組大鼠血漿生化指標(biāo)結(jié)果比較

對(duì)照組大鼠血漿總膽固醇明顯低于高脂組和慶大霉素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，慶大霉素組大鼠血漿低密度脂蛋白水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。3組間大鼠血漿甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇和C反應(yīng)蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 大鼠血漿生化指標(biāo)結(jié)果比較

*P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與對(duì)照組比較。

2.4 3組大鼠空腹血糖、胰島素濃度及HOMA-IR比較

由表4可知，高脂組大鼠空腹血糖水平明顯低于對(duì)照組和慶大霉素組(P<0.05)；高脂組大鼠空腹胰島素水平明顯高于對(duì)照組大鼠(P<0.05)；且慶大霉素組空腹胰島素水平和HOMA-IR明顯低于對(duì)照組和高脂組大鼠空腹胰島素水平和HOMA-IR(P<0.05)。

表4 3組大鼠空腹血糖、胰島素濃度及HOMA-IR比較

*P<0.05，與對(duì)照組比較； #P<0.05，與對(duì)照組比較；△P<0.05，與高脂組比較。

3 討論

實(shí)驗(yàn)過程中各組大鼠體質(zhì)量并無明顯差異；高脂喂食可誘導(dǎo)大鼠糖、脂代謝紊亂、胰島素抵抗及血壓升高；硫酸慶大霉素能較好的緩解高脂喂食所致大鼠的代謝綜合征，其中在緩解胰島素抵抗及升高的血壓方面效果突出。

目前，關(guān)于高脂喂食與體質(zhì)量關(guān)系的研究報(bào)道結(jié)果仍不一致。有研究報(bào)道高脂喂食大鼠與普通喂食大鼠相比，體質(zhì)量有增加趨勢(shì)甚至發(fā)展為肥胖[9-10]，也有研究認(rèn)為高脂喂食較普通喂食并不能影響大鼠體質(zhì)量[11]，甚至觀察到高脂喂食可使大鼠體質(zhì)量下降，且認(rèn)為可能與高脂喂食大鼠總能量攝取減少及瘦素受體對(duì)瘦素敏感度增高相關(guān)[12]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高脂喂食長達(dá)至24周時(shí)其體質(zhì)量才較普通喂食組高[13]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究組認(rèn)為：高脂喂食對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響結(jié)果尚不確切，可能受喂養(yǎng)時(shí)間、總能量攝入等多方面因素的影響。

王亞萍等[3]研究發(fā)現(xiàn)：高脂喂食導(dǎo)致大鼠全面的糖、脂代謝紊亂。然而，劉艦杭等[11]與王燕萍等[14]先后報(bào)道了高脂喂食SD大鼠建立高膽固醇血癥模型是成功的，但高脂喂食組和對(duì)照組比較血甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白差異無顯著性，他們認(rèn)為這與高脂喂食大鼠厭食以及膽固醇代謝內(nèi)調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)高脂喂食僅能使大鼠血膽固醇升高。與本實(shí)驗(yàn)相似的兩項(xiàng)研究均采用的是高甘油三酯為主的高脂喂食，而王亞萍等[3]人的研究是采用高膽固醇為主的高脂喂食。雖然目前對(duì)造成這種差異結(jié)果的機(jī)制尚不清楚，但也為今后建立大鼠糖、脂代謝紊亂模型提供了更多的依據(jù)。

“胰島素抵抗”在代謝綜合征的病因機(jī)制中處于中心地位[15]。既往研究證實(shí)：高脂喂食通過免疫炎癥介導(dǎo)小鼠胰島素抵抗，而口服抗生素可緩解高脂喂食所致大鼠的胰島素抵抗[16-17]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果—高脂喂食組較普通喂食組大鼠胰島素抵抗增強(qiáng)，慶大霉素干預(yù)后胰島素抵抗明顯減弱的結(jié)果高度一致。然而，抗生素干預(yù)后又是通過何種機(jī)制來緩解高脂喂食大鼠胰島素抵抗則有待進(jìn)一步研究。

高血壓作為代謝綜合征的主要特征之一，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)有明顯上升趨勢(shì)[18]。大量研究發(fā)現(xiàn)高脂喂食不僅可使大鼠收縮壓及舒張壓顯著升高[3,19-20]，而且也能通過免疫炎癥介導(dǎo)小鼠胰島素抵抗[16]，提示高血壓與胰島素抵抗密切相關(guān)[17]?？诜股乜赏ㄟ^調(diào)節(jié)腸道菌群減緩大鼠血壓的升高[6]、也可緩解高脂喂食所致大鼠的胰島素抵抗[17]。本研究發(fā)現(xiàn)高脂喂食可使大鼠收縮壓明顯升高，于實(shí)驗(yàn)第9周開始用硫酸慶大霉素灌胃干預(yù)，被干預(yù)大鼠血壓下降；連續(xù)2周干預(yù)后，即實(shí)驗(yàn)第11周，慶大霉素組大鼠與對(duì)照組大鼠收縮壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，可以認(rèn)為，高脂喂食可能通過誘導(dǎo)胰島素抵抗引起大鼠血壓升高，推測(cè)硫酸慶大霉素很可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群減輕胰島素抵抗以控制升高的血壓。

在本實(shí)驗(yàn)過程中不容忽視的是，硫酸慶大霉素組有3只大鼠死亡，尸體解剖均發(fā)現(xiàn)肺部有嚴(yán)重的化膿感染灶，雖然硫酸慶大霉素抑制腸道菌群方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[7]，但長期使用亦可致二重感染；各組大鼠C反應(yīng)蛋白濃度無明顯差異，說明各組存活的大鼠均未受到急性感染的干擾，排除了感染因素對(duì)血壓的影響。通過進(jìn)一步優(yōu)化給藥方式以期改善二重感染，或者利用其它手段減輕胰島素抵抗有望成為干預(yù)高血壓等代謝性疾病的新的重要靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)以高甘油三酯為主的高脂喂食并不能導(dǎo)致大鼠體重增加和機(jī)體的糖、脂代謝紊亂；硫酸慶大霉素灌胃干預(yù)可減輕高脂喂食所致的胰島素抵抗和血壓升高。