陳蓉，羅家明，張微，胡為民，楊健，朱紅

(1.川北醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室；2.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；3.川北醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000)

COL9A2 基因又名IX型膠原α2(collagen type IX alpha 2 chain)，為膠原類(collagen)基因家族中1員，位于1p34.2。整個基因組大致包括32個外顯子，大小約2 889 bp，翻譯的蛋白質(zhì)大概有689個氨基酸，蛋白質(zhì)大小約65 131 Da。COL9A2 基因系蛋白編碼基因，編碼IX型膠原蛋白，主要編碼IX型膠原α2鏈，其為1個共價鍵連接的糖胺聚糖側(cè)鏈。膠原類基因主要編碼細胞外基質(zhì)膠原成分，眼鞏膜由細胞外基質(zhì)膠原與少量其他細胞組成，其中膠原約占鞏膜的90%，膠原減少可能與病理性近視發(fā)病密切相關(guān)[1]。膠原類基因在眼軸長度變化中發(fā)揮重要作用，其主要包括COL9A2基因、COL9A1基因、COL9A3基因、COL11A1基因、COL11A2基因、COL2A1基因等[2-7]。COL9A2 基因主要表達于鞏膜、胸腺、大腦、心肌、骨骼肌、平滑肌等，其中鞏膜分布最廣泛[8-9]。據(jù)報道，COL9A2 基因突變或許會減少鞏膜組織中的膠原成分，從而使眼軸延長，導(dǎo)致病理性近視[10]。

本研究團隊?wèi)?yīng)用Sanger測序，在病理性近視患者中檢測到COL9A2 基因2個突變位點，即G143C、G884A雜合突變[11]。為探尋COL9A2 基因突變型G143C、G884A是否與病理性近視的發(fā)病有關(guān)，本研究運用基因工程技術(shù)進行人COL9A2 基因克隆和序列分析，應(yīng)用定點突變法，構(gòu)建COL9A2 基因野生型和突變型G143C、G884A的真核表達質(zhì)粒，并進行鑒定。有望為COL9A2 基因功能研究提供幫助，為進一步探索病理性近視的發(fā)生、發(fā)展機制，研發(fā)病理性近視早期診斷方法及治療措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶HindⅢ(北京博凌科為生物科技有限公司)，BamHⅠ (上海純優(yōu)生物科技有限公司)，T4 DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司)，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，PCR擴增試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)，DNA molecular marker(Thermo Fisher Scientific)，模板DNA由四川省人民醫(yī)院分子遺傳中心贈予，定點突變試劑盒(賽默飛世爾科技公司)。

1.1.2 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)擴增引物 從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_001852.3) 獲得基因序列及酶切位點序列。Primer3 網(wǎng)絡(luò)輔助設(shè)計引物(引物序列見表1)，點突變引物在引物兩端分別加入HindⅢ與BstBI酶切位點，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 COL9A2基因野生型與突變型引物序列

1.1.3 菌種與質(zhì)粒 E.coli DH5α感受態(tài)細胞(大連寶生物工程有限公司)，pUC57空質(zhì)粒(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 基因保守度分析 在NCBI中的homologene，對COL9A2基因突變位點進行進化保守性分析，網(wǎng)站為http://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene。

1.2.2 PCR擴增COL9A2基因 共50 μL體系：Pfu DNA聚合酶25 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix 5 μL，正向引物2.5 μL，反向引物2.5 μL，模板DNA 2.5 μL，Sterilized dd H2O補足50 μL，退火溫度61 ℃。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，不同引物在其相應(yīng)退火溫度退火30 s，72 ℃延伸1 min，以上反應(yīng)進行38個循環(huán)；完成上述循環(huán)后，72 ℃延伸10 min，12 ℃保溫。取PCR產(chǎn)物3 μL于1.2% 瓊脂糖進行電泳，獲得清晰、片段大小正確的COL9A2基因條帶[12]。

1.2.3 COL9A2基因克隆 根據(jù)定點突變試劑盒說明書操作步驟，誘導(dǎo)定點突變，將COL9A2基因野生型與G143C、G884A突變型插入pUC57-sgRNA expression vector中。pUC57具有氨芐抗性，是大腸桿菌中常用的質(zhì)粒克隆載體，長度約為2 710 bp，使用標準方法從大腸桿菌DH5α中分離。用HindⅢ和BamHⅠ 對野生型、突變型與pUC57進行雙酶切，電泳后，取片段大小正確的產(chǎn)物進行膠回收。膠回收產(chǎn)物用T4連接酶16 ℃ 連接12 h。連接產(chǎn)物電泳，獲得清晰、片段大小正確的條帶后，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞，半小時后接種于帶氨芐抗性的平板培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜[13]。第2天，隨機挑選單個菌落，接種于200 mL培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖床搖菌過夜，取1 mL菌液送上海生工生物工程股份有限公司進行全基因測序。所測堿基序列與COL9A2基因野生型及G143C、G884A突變型一致后，制備大量質(zhì)粒，供后續(xù)研究使用。

2 結(jié)果

2.1 基因保守度分析結(jié)果

COL9A2基因突變型G143C的氨基酸位置為p.Gly48Ala；G884A的氨基酸位置為p.Gly295Asp。經(jīng)homologene進行基因保守度分析，發(fā)現(xiàn)COL9A2基因p.Gly48Ala與p.Gly295Asp在不同物種中具有高度保守性，見圖1。

2.2 酶切、連接產(chǎn)物電泳結(jié)果

COL9A2基因野生型與突變型PCR產(chǎn)物插入pUC57-sgRNA expression vector載體后，用HindⅢ和BamHⅠ 對野生型、突變型與pUC57進行雙酶切，1.2%瓊脂糖進行電泳，可見一大一小兩個片段，與Marker對比，大片段約為5 599 bp，小片段不到1 000 bp，片段大小與目的條帶大小相符，見圖2。

COL9A2基因大小約2 889 kb，pUC57-sgRNA expression vector大小約2 710 kb，COL9A2基因野生型與G143C、G884A突變型插入pUC57-sgRNA expression vector后連接，連接產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖進行電泳，連接產(chǎn)物片段大小約5 599，與目的片段大小相符，見圖3。

2.3 COL9A2基因野生型與突變型質(zhì)粒鑒定

菌液送上海生工生物工程股份有限公司進行基因測序。測序檢測驗證，COL9A2基因野生型堿基序列與GeneBank (Gene ID:1298)上序列完全一致，G143C突變型除143位堿基G被C取代外，其余序列與野生型序列完全一致；G884A突變型除884位堿基G被A取代外，其余序列與野生型序列完全一致。見圖4。

3 討論

COL9A2 基因突變主要與膠原成分含量較高的器官或組織病變相關(guān)，膠原含量較高的主要有鞏膜、椎間盤等[14]。研究表明COL9A2 基因Gln326Arg突變或許會導(dǎo)致椎間盤病變[2]，COL9A2 基因GCAGCG缺失可能會使椎管狹窄[15]。Hyun等[4]研究發(fā)現(xiàn)，COL9A2 基因c.843_c.846缺失突變或許會引起常染色體隱性遺傳病Stickler綜合，Guo等[16]進一步證實COL9A2 基因突變也許會導(dǎo)致Stickler綜合，病理性近視是Stickler綜合患者主要臨床表現(xiàn)之一。研究顯示，COL9A2 基因突變或過度表達或許會使鞏膜組織堆積，而影響鞏膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致眼軸延長[17]。眼軸延長是病理性近視主要病理改變之一，且病理近視患者眼軸延長可遺傳給下一代[18]。

本研究團隊?wèi)?yīng)用Sanger測序技術(shù)，對200例病理性近視患者與200名健康者對照的COL9A2 基因全部外顯子及其側(cè)翼進行測序檢測。在1例病理性近視患者的COL9A2 基因2號外顯子檢測到G143C(c.143G>C)突變，導(dǎo)致的氨基酸改變?yōu)閜.Gly48Ala；在另1例病理性近視患者的COL9A2 基因17號外顯子檢出G884A(c.884G>A)突變，導(dǎo)致的氨基酸改變?yōu)閜.Gly295Asp，其他病理性近視與健康對照組中未檢測到上述突變位點[11]。

經(jīng)HomoloGene進行基因保守度分析，COL9A2 基因G143C、G884A位點在不同物種中高度保守，說明上述位點突變，可能會導(dǎo)致COL9A2 基因表達異常或功能改變。病理性近視患者中檢測到COL9A2 基因G143C、G884A突變位點，由此推測COL9A2基因突變或許是病理性近視發(fā)生、發(fā)展的危險因素之一。為研究COL9A2基因突變在病理性近視的發(fā)病機制中的影響，構(gòu)建COL9A2基因野生型與突變型質(zhì)粒是關(guān)鍵。本研究成功構(gòu)建了COL9A2 基因野生型及G143C、G884A突變型質(zhì)粒，經(jīng)Sanger測序檢測，序列與預(yù)期相符。本研究團隊擬行COL9A2 基因功能研究，進一步研究其在病理性近視發(fā)病機制中發(fā)揮的作用。本研究構(gòu)建的pUC57-COL9A2基因野生型、pUC57-p.Gly48Ala和pUC57-p.Gly295Asp突變型質(zhì)粒，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。