馮俊，李麗 ，楊久梅，莊元卓，彭濤,王朝莉

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科；2.川北醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；3.川北醫(yī)學(xué)院分子生物研究所，四川 南充 637000)

喉癌是耳鼻咽喉科常見(jiàn)病、多發(fā)病，98%為鱗狀細(xì)胞癌，隨著環(huán)境污染加劇發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，位列我國(guó)頭頸惡性腫瘤第三位[1]。隨著技術(shù)的發(fā)展，基因治療成為晚期腫瘤患者的選擇之一。凋亡抑制蛋白家族中的成員之一，Livin(inhibitor of a apoptosis protein， IAPs)，與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

人喉鱗癌細(xì)胞株由華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)；Lentivirus載體由川北醫(yī)學(xué)院組織與干細(xì)胞研究所贈(zèng)送。

1.2 病例及標(biāo)本

選用2012年10月至2016年3月川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院術(shù)后87例喉癌標(biāo)本、79例癌旁組織(距腫瘤組織0.5 cm)作樣本。所有喉癌均經(jīng)病理學(xué)確診為喉鱗癌細(xì)胞癌，癌旁組織未檢測(cè)出癌細(xì)胞。87例患者中，聲門(mén)型喉癌61例，聲門(mén)上型喉癌21例，聲門(mén)下型喉癌5例；男性82例，女性5例，年齡45～83歲，平均61.3歲；19例有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNM分期：T1～T2級(jí)59例，T3～T4級(jí)28例?；颊咝g(shù)前未接受放療或化療；組織分化程度：高分化鱗癌62例，中分化鱗癌21例，低分化鱗癌4例。所有標(biāo)本送病理科固定保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑

RPMI-1640、Livin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司、Opti-MEM I購(gòu)自中國(guó)Takara公司；LipofectamineTM2000、GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司； 自中國(guó)邁新公司購(gòu)買(mǎi)MaxVisionTM試劑盒。PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；BCIP/NBT購(gòu)自中國(guó)Takara公司。

1.4 Livin基因目標(biāo)序列的選擇及siRNA的設(shè)計(jì)與合成

針對(duì)Livin基因序列(NCBI Reference Sequence:NM_022161.2)，按照siRNA序列設(shè)計(jì)原則[3-4]，設(shè)計(jì)出siRNA靶點(diǎn)序列(SH1-4)，同時(shí)設(shè)計(jì)一段序通用序列作陰性對(duì)照(NC)；經(jīng)BLAST分析均不與任何人cDNA序列同源。siRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定(另文敘述)。最佳靶點(diǎn)序列為BIRC7-SH2，質(zhì)粒pLenOR-THM-Livin-SH2；正義鏈(SH2-F)：CGCGTCCCCGCCCTGTCCTAGGCCTGGACATTCAAGAGATGTCCAGGCCTAGGACAGGGCTTTTTGGAAA；反義鏈(SH2-R)：CGATTTCCAAAAAGCCCTGTCCTAGGCCTGGACATCTCTTGAATGTCCAGGCCTAGGACAGGGCGGGGA。陰性對(duì)照(NC)：CGCGTCCCCTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGGAAAT

1.5 多核苷酸轉(zhuǎn)染喉鱗癌細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)分為SH2-R(反義鏈組)、SH2-F(正義鏈組)、NC (陰性對(duì)照)組。將生長(zhǎng)良好的Hep-2約2×105，培養(yǎng)于多孔板中(6或12孔板)，于37 ℃ 5%CO2孵箱中備用。各取pLenOR-THM-Livin-SH2-R、pLenOR-THM-Livin-SH2-F、pLenOR-THM-Livin-SH2-NC及脂質(zhì)體 2 000 加入Opti-MEM I中，于室溫下共育5 min。將核苷酸與脂質(zhì)體2 000 于室溫下共育20 min，然后在孵箱中與Hep-2細(xì)胞作用，6 h后用PBS洗兩次，吸凈PBS，加入RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃ 5%CO2孵箱中24 h備用。

1.6 Western blot分析喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Livin蛋白

取1.5所述的核苷酸轉(zhuǎn)移細(xì)胞1×106，以裂解液提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)Bradford法檢測(cè)蛋白濃度及確定液體積，取出PVDF膜(經(jīng)甲醇活化)，在TBST中清洗1 min，然后用封閉液封閉過(guò)夜。用封閉液將對(duì)應(yīng)的一抗Livin單克隆抗體稀釋成一定的濃度1∶200，內(nèi)參GAPDH的稀釋終濃度為1∶3 000,室溫下共育1.5 h。用TBST清洗3次，每次5 min,加HRP標(biāo)記的二抗。將 A試劑2 mL和 B試劑混合，滴在PVDF膜的正面，室溫孵育2 min，進(jìn)入暗室，PVDF膜上蓋一層保鮮膜，擦去多余的發(fā)光劑。暗室膠片顯影、定影、掃描。

1.7 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色參照MaxVision法。每張切片滴50 μL 3%H2O2孵育10 min,PBS沖洗3次，每次3 min，加入Livin單克隆抗體50 μL，孵育60 min，PBS沖洗3次，每次3 min，加入50 μL MaxVisionTM試劑，室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，每張切片滴加100 μL DAB,10 min后自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染。

1.8 免疫組化染色結(jié)果判定

免疫組化染色結(jié)果陽(yáng)性以細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)，染色細(xì)胞計(jì)數(shù)及染色強(qiáng)度據(jù)劉學(xué)軍等[5]介紹的方法進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Livin蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)和各臨床參數(shù)之間的關(guān)系

由表1可見(jiàn)，喉鱗癌組織中Livin表達(dá)陽(yáng)性率為71.26%，顯著高于癌旁喉組織。由表2可見(jiàn)TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期喉癌陽(yáng)性表達(dá)率為89.28%，明顯高于TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期喉癌；在喉鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者Livin陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)73.68%，高于頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者。Livin基因表達(dá)在不同性別、不同年齡、不同臨床分型間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 Livin蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果

Livin蛋白陽(yáng)性顆粒呈棕黃色,主要定位于喉癌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi),喉癌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞核和細(xì)胞間質(zhì)都可見(jiàn)少量陽(yáng)性染色。見(jiàn)圖1、圖2。

表1 Livin基因在喉癌組織和癌旁喉組織中的表達(dá)

表2 Livin蛋白的表達(dá)與各臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.3 Western blot分析各組的Livin蛋白表達(dá)

由圖3可見(jiàn)，SH2-R組的Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量最低為(12.31±4.43)%；用SPSS 22.0 軟件分析各組蛋白表達(dá)灰度可以得出，SH2-R組與SH2-F、 NC組比較，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SH2-F、 NC組之間比較，P>0.05，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

Livin是凋亡抑制蛋白家族成員之一，其基因位于人類第20號(hào)染色體q13．3上，包括7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)46 kb[6-8]。Livin抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是：通過(guò)激活TAKI/JNK1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抗凋亡；抑制caspase途徑：Livin能與caspase前體蛋白和其激活形式結(jié)合從而抑制其功能,阻斷其級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而抑制凋亡的進(jìn)程，阻礙多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[9-11]。Yoon等[2]研究提示沉默Livin基因在喉咽鱗癌組織中的表達(dá)，可以抑制喉癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及侵襲。Zhao等[12]研究顯示抑制Livin 在肺癌組織中表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的凋亡。Cho等[13]通過(guò)siRNA抑制肝癌細(xì)胞Livin的表達(dá)，顯示Livin基因與肝癌細(xì)胞的侵襲相關(guān)。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)Livin siRNA作用于喉鱗狀細(xì)胞癌來(lái)減少Livin表達(dá)，進(jìn)而分析能否增強(qiáng)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Livin蛋白的降低。

本研究顯示，喉鱗癌組織中Livin表達(dá)陽(yáng)性率為71.26%，顯著高于癌旁喉組織(在癌旁組織中無(wú)表達(dá))；喉鱗癌組織中Livin表達(dá)陽(yáng)性率為71.26%，顯著高于癌旁喉組織。TNM分期中Ⅲ+Ⅳ期喉癌陽(yáng)性表達(dá)率為89.28%，明顯高于TNM分期中Ⅰ+Ⅱ期喉癌；在喉鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者Livin陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)73.68%，高于頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者。Livin基因表達(dá)在不同性別、不同年齡、不同臨床分型間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Western blott分析各組Livin蛋白時(shí)，SH2-R組的Livin蛋白相對(duì)表達(dá)量最低(12.31±4.43)%，這可能是由于SH2-R Livin多核苷酸抑制了Livin的表達(dá)，進(jìn)而促使喉鱗癌細(xì)胞mRNA、Livin蛋白的降低；而SH2-F、 NC組的Livin蛋白表達(dá)量較高，這可能是由于SH2-F、NC組多核苷酸對(duì)Livin mRNA無(wú)抑制作用，故SH2-R組Livin蛋白與SH2-F、NC組間比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SH2-F、NC組間Livin蛋白比較，無(wú)顯著差異。本研究揭示SH2-R-Livin核苷酸在喉鱗癌細(xì)胞內(nèi)可以減少Livin蛋白表達(dá)。

本研究結(jié)果表明，Livin基因在臨床分期Ⅲ+Ⅳ及頸部淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移者中高表達(dá)，而SH2-R Livin多核苷酸可以在體外使喉鱗癌細(xì)胞中Livin表達(dá)降低。接著我們會(huì)將SH2-R Livin多核苷酸作用喉鱗癌細(xì)胞及用于裸鼠移植瘤來(lái)進(jìn)行體外體內(nèi)研究其能否促進(jìn)喉鱗癌細(xì)胞的凋亡，為將潛在的基因治療運(yùn)用于喉鱗癌患者提供依據(jù)。