王南宇，楊 科，崔申申，張祝琴，劉德培

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100005)

人的β-珠蛋白基因簇隨著個體發(fā)育進(jìn)程，依次表達(dá)ε-珠蛋白、γ-珠蛋白基因、β-珠蛋白基因，該珠蛋白基因表達(dá)轉(zhuǎn)換過程受到嚴(yán)格的時空特異性調(diào)控，是一個復(fù)雜精細(xì)的真核基因表達(dá)調(diào)控事件[1]。由于成年期β-珠蛋白基因編碼結(jié)構(gòu)的突變或表達(dá)量的減少導(dǎo)致的β-血紅蛋白病是世界上最大的單基因遺傳病，而在成年期開啟胎兒期表達(dá)的γ-珠蛋白基因，可以治療β-血紅蛋白病[2]。因此，研究γ-向β-珠蛋白基因的表達(dá)轉(zhuǎn)換，不僅在基因表達(dá)調(diào)控理論上還是臨床應(yīng)用上都具有很大的意義。

但是參與該過程的重要調(diào)控因子KLF1和BCL11A的敲除并不能在成年期有效開啟γ-珠蛋白基因的表達(dá)，提示更多的調(diào)控因子參與了γ-向β-珠蛋白基因的表達(dá)轉(zhuǎn)換[3]。本研究通過對不同組織來源細(xì)胞間γ-和β-珠蛋白基因差異表達(dá)的兩組RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，預(yù)測潛在的γ-和β-珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控因子，以期對γ-和β-珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控的研究提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

用不同組織來源細(xì)胞間γ-和β-珠蛋白基因差異表達(dá)的兩組RNA-seq數(shù)據(jù)(美國國立生物信息中心的基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gob/geo/)，其一組的登錄號為GSE102201，是將人類胎肝和成年外周血中的CD34+造血干祖細(xì)胞(HSPC)進(jìn)行體外誘導(dǎo)紅系分化，在分化第11天和第14天分別收樣并用Illumina NextSeq 500進(jìn)行RNA-seq[4]；另一組為GSE107218、GSE53983，是對人類臍帶血和外周血來源的CD34+HSPC分別進(jìn)行體外誘導(dǎo)紅系分化，并分離紅系分化各個時期如原始紅細(xì)胞(proerythroblast,PRO)、早期早幼紅細(xì)胞(early basophilic erythroblast,EBASO)、晚期早幼紅細(xì)胞(late basophilic erythroblast,LBASO)、中幼紅細(xì)胞(polychromatophilic erythroblast,POLY)、晚幼紅細(xì)胞(orthochromatic erythroblast,ORTHO)，用Illumina HiSeq 2500對其進(jìn)行RNA-seq[5-6]。

1.2 方法

1.2.1 RNA-seq數(shù)據(jù)處理與差異表達(dá)基因的分析：用fastq-dump命令下載兩組RNA-seq數(shù)據(jù)，并用FastQC和Trimmomatic-0.36分別對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量檢測和去除低質(zhì)量和測序接頭序列后用HISAT2和featureCounts分別將序列比對至人類參考基因組上并對應(yīng)到具體的基因得到相應(yīng)的counts值，完成對該數(shù)據(jù)的定量分析。接著用DESeq2對相同分化時期不同組織來源細(xì)胞間差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選P<0.05且│log2 FoldChange│≥1的基因為差異表達(dá)基因。

1.2.2 差異表達(dá)基因的IPA分析：IPA(Ingenuity Pathway Analysis)是基于龐大的Ingenuity Knowledge Base數(shù)據(jù)庫，可搜索基因、蛋白、疾病與經(jīng)典通路等相關(guān)信息，并預(yù)測分子集群參與的經(jīng)典通路、生物過程、上游調(diào)控子等信息[7]。本研究利用IPA對相應(yīng)差異表達(dá)基因進(jìn)行上游調(diào)控因子的預(yù)測。

1.2.3 差異基因編碼蛋白以及上游調(diào)控因子的相互作用分析及關(guān)鍵基因的預(yù)測：將差異表達(dá)基因編碼蛋白以及其預(yù)測出的上游調(diào)控因子一起導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，分析各因子間的相互作用，進(jìn)而用Cytoscape中的CentiScape插件預(yù)測其調(diào)控關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選

從GSE102201數(shù)據(jù)中篩選出分化第11天外周血與胎肝來源細(xì)胞間差異表達(dá)基因為1 857個，分化第14天的差異表達(dá)基因為1 530個，共同的差異表達(dá)基因為635個；從GSE107218、GSE53983數(shù)據(jù)庫中篩選出原始紅細(xì)胞時期外周血與臍帶血來源細(xì)胞間差異表達(dá)基因為578個，早期早幼紅細(xì)胞時期為610個，晚期早幼紅細(xì)胞時期為358個，中幼紅細(xì)胞時期為1 987個，晚幼紅細(xì)胞時期為1 812個，共同的差異表達(dá)基因為173個(表1)。

2.2 差異表達(dá)基因的IPA分析

不同的組織來源決定了γ-和β-珠蛋白基因的差異表達(dá)模式，因此差異表達(dá)基因的上游調(diào)控因子也可能是潛在的調(diào)控因子。通過IPA對外周血與胎肝來源間不同分化時期共有的差異表達(dá)基因進(jìn)行上游調(diào)控因子的預(yù)測，共預(yù)測出111個；對外周血與臍帶血來源間不同分化時期共有的差異表達(dá)基因進(jìn)行上游調(diào)控因子的預(yù)測，共預(yù)測出30個，如表2所示前20個。

2.3 γ-和β-珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控因子的預(yù)測

過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape對外周血與胎肝來源間不同分化時期共有的635個差異表達(dá)基因及其預(yù)測出的111個上游調(diào)控因子進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用分析和展示(圖1)，并利用Centiscape計算蛋白質(zhì)間相互作用的強(qiáng)度， 按照Degree unDir大小進(jìn)行排序，預(yù)測出148個潛在的調(diào)控因子(其Degree unDir大于BCL11A)； 對外周血與臍帶血來源間不同分化時期共有的173個差異表達(dá)基因及其預(yù)測出的30個上游調(diào)控因子進(jìn)行同樣的分析，共預(yù)測出41個潛在的調(diào)控因子。其中，共同預(yù)測出潛在的調(diào)控因子有14個，為MAPK1、TNF、IFNG、MPO、LGALS3、CEBPA、BRD2、COL18A1、CA2、SELPLG、COL4A5、THBD、MAPKAPK3、CAMK2D。

圖1 外周血與胎肝來源間差異表達(dá)基因及上游調(diào)控因子間的蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Protein-protein interaction network of differentially expressed genes and upstream regulators derived from peripheral blood and fetal liver

3 討論

γ-和β-珠蛋白基因表達(dá)受眾多調(diào)控因子的調(diào)控，大量有關(guān)γ-和β-珠蛋白差異表達(dá)組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，使利用生物信息學(xué)手段挖掘更多參與珠蛋白表達(dá)的調(diào)控因子成為可能。本研究通過對珠蛋白基因差異表達(dá)相關(guān)的RNA-seq結(jié)果進(jìn)行分析，利用相應(yīng)的共有差異表達(dá)基因及其預(yù)測的上游調(diào)控因子進(jìn)行蛋白質(zhì)間相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，其中包括BCL11A、NF-E2、GATA1、GATA2、YY1等已知的γ-和β-珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控因子，并預(yù)測到14個潛在的調(diào)控因子。其中預(yù)測出的前3個潛在因子MAPK1、TNF、IFNG均與β類珠蛋白基因的表達(dá)有關(guān)，如MAPK1參與到了一些小分子藥物通過表觀修飾改變影響γ-珠蛋白基因表達(dá)的過程中[8]，除此之外，在紅系分化過程當(dāng)中，G蛋白偶聯(lián)受體也可通過JUN和MAPK1信號通路激活γ-珠蛋白基因的表達(dá)[9-10]；IFNG可通過NF-κB/Jun信號通路抑制活化素A/NF-E2對紅系基因包括ζ-珠蛋白基因的表達(dá)激活作用[11]，也發(fā)現(xiàn)IFNG在臍帶血、成年外周血來源的紅細(xì)胞中均可影響珠蛋白基因的表達(dá)，而且在臍帶血、成年外周血來源的紅細(xì)胞中均可影響珠蛋白基因的表達(dá)，而且在鐮刀型細(xì)胞貧血癥和地中海貧血患者來源的紅系祖細(xì)胞中IFNG可抑制γ-珠蛋白基因的表達(dá)[12]， TNF的單克隆抗體在治療強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)時也可明顯提升血紅蛋白的表達(dá)水平[13]。而預(yù)測出的潛在的γ-和β-珠蛋白基因表達(dá)調(diào)控因子的準(zhǔn)確性需要后續(xù)的分子生物學(xué)實驗進(jìn)行驗證。