韋 慧, 王炎秋, 張迅軼, 紀亞忠
(同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學科,上海 200065)
體外受精-胚胎移植(in vitro fertility-embryo transfer, IVF-ET)結(jié)局主要受患者年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)、不孕因素、激素水平、移植胚胎的數(shù)量和質(zhì)量、內(nèi)膜情況等多種因素的影響??刂菩源倥怕?controlled ovarian stimulation, COS)周期發(fā)育良好的卵泡中是否存在成熟的卵母細胞是臨床醫(yī)生和胚胎師關(guān)注的焦點。對于卵母細胞來說,卵泡液是賴以生存的微環(huán)境,可以鏡像反應(yīng)卵細胞發(fā)育情況。因此,了解卵泡液的成分,對于認識卵母細胞發(fā)育潛能及受精等活動具有重要意義。囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)是由囊性纖維化(cystic fibrosis, CF)基因編碼的一種氯離子通道蛋白,Riordan 等于1989年首次克隆成功。CFTR蛋白在正常情況下廣泛表達于呼吸道、胰腺、汗腺、小腸及生殖道等多種組織的上皮細胞上,負責對鹽和水份進行跨上皮細胞的轉(zhuǎn)運,在維持和穩(wěn)定機體局部液體微環(huán)境穩(wěn)態(tài),維持機體正常的生理功能具有重要的作用。離子通道蛋白是影響液體微環(huán)境的重要調(diào)控因子。CFTR作為子宮中唯一的Cl-通道,控制著宮頸、宮腔的液體分泌,從而對在女性生殖道中精子的獲能、游走、卵子受精、胚胎著床等一系列生殖事件進行調(diào)控。本研究探討不孕女性患者卵泡液中CFTR的表達,旨在研究CFTR與女性年齡的關(guān)系和在女性生殖、生理中的作用及與人卵泡、胚胎正常生長的調(diào)控。
選擇2016年12月至2017年9月在同濟大學附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學科行常規(guī)IVF/ICSI-ET助孕治療的患者80例,患者年齡25~52歲,按照年齡分為三組,A組≤35歲(n=28);B組36~39歲(n=29);C組≥40歲(n=23)。該研究經(jīng)本院倫理委員會批準,并與所有患者簽署書面知情同意書。
1.2.1 標本采集 空腹抽取80例患者月經(jīng)第2~3日、注射HCG日靜脈血送檢。收集80例患者行控制性促排卵扳機后,取卵日第1管卵泡直徑>15mm成熟卵泡的清亮、無血染的混合卵泡液,置離心管內(nèi),2000 r/min,離心半徑20cm,離心10min,去除顆粒細胞,小心吸取上清液裝入無菌Eppendorf管中,封口,標記后置于-20℃冰箱中保存待測。卵母細胞外周包裹著卵丘及放射冠顆粒細胞,在ICSI操作前,要去除卵周顆粒細胞,對MII期的卵子進行單精子注射。通過在培養(yǎng)液中加入一定濃度的透明質(zhì)酸酶,然后應(yīng)用適合口徑的吸管反復吹吸去除卵周細胞。收集進行ICSI“拆卵”時通過透明質(zhì)酸酶消化剝離的顆粒細胞,將細胞種至培養(yǎng)皿中放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h待測。
1.2.2 控制性促排卵方案 80個周期均采取拮抗劑方案,具體方案如下。拮抗劑方案: 患者在月經(jīng)第3日開始應(yīng)用Gn(起始劑量75~300 IU),根據(jù)卵泡發(fā)育情況適時調(diào)節(jié)Gn用量及添加拮抗劑(思則凱,瑞士默克)0.25mg或拮抗劑(歐加利,荷蘭默沙東)0.25mg每日1次,直至hCG注射日。當至少2個卵泡直徑達18mm或3個卵泡直徑達17mm時,給予人絨毛膜促性腺激素(HCG,上海麗珠制藥有限公司)4000~8000 IU注射,36h后行陰式B超引導下穿刺取卵術(shù),進行IVF/ICSI授精。
1.2.3 雙抗體夾心ABC-ELISA法測定CFTR蛋白用抗人CFTR單抗(購自中國上海志立生物公司)包被于酶標板上,標準品和樣品中的CFTR與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗人CFTR,形成免疫復合物連接在板上,辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合,加入底物工作液顯藍色,最后加終止液硫酸,在450nm處測吸光度值(A450),CFTR濃度與A值成正比,通過繪制標準曲線求出標本中CFTR濃度。
1.2.4 間接免疫熒光染色法檢測顆粒細胞上CFTR蛋白的定位及表達 將培養(yǎng)后的卵丘顆粒細胞經(jīng)4%多聚甲醛室溫固定20min后,加入0.3% Triton室溫通透30min;細胞加入10%山羊血清封閉液常溫封閉30min;隨后加入小鼠抗CFTR抗體(1∶100稀釋,Abcam,ab2784),放4℃冰箱過夜;將標本復溫,細胞經(jīng)漂洗后,加入FITC標記山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶50稀釋,YEASEN,33207ES60),37℃孵育30min;細胞核采用DAPI染色;倒置熒光顯微鏡下觀察CFTR的細胞定位情況。
1.2.5 Real-time PCR法檢測CFTR基因表達 TRIzol法提取顆粒細胞總RNA(TRIzol裂解液購自美國Invitrogen公司),將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(試劑購自Fermentas公司),取RT產(chǎn)物應(yīng)用ABI Prism 7500 SDS進行real-time PCR(SYBRGreen熒光染料購自上??針飞锟萍加邢薰?。引物由上海華大基因公司合成。real-time PCR總反應(yīng)體系50μL,將制備好的cDNA進行PCR擴增,引物序列如下。CFTR上游引物: 5′-TGTAAATGGAGG-AGGAAATG-3′,下游引物: 5′-GAGAAGATGATA-AGTGGGAAA-3′;β-actin上游引物: 5′-CTGGGA-CGACATGGAGAAAA-3′;下游引物: 5′-AAGGA-AGGCTGGAAGAGTGC-3′。擴增程序為: 95℃作用5min,95℃作用15s,60℃作用45s 40個循環(huán)。PCR反應(yīng)后,在60~95℃進行熔解曲線分析。通過實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物的動態(tài)積累量,得到各管標本的擴增曲線、熔解曲線及目的序列的Ct值,同時檢測該管標本管家基因β-actin的Ct值,計算各管標本待測序列的△Ct值(△Ct=目的基因Ct值-該管樣品β-actin的Ct值),該管標本目的基因的相對表達量為2-ΔCt值。
1.2.6 胚胎實驗室數(shù)據(jù)統(tǒng)計 授精72h后檢查胚胎發(fā)育情況,胚胎分為5級。1級: 7~10細胞,細胞碎片<5%,卵裂球均一性好。2級: 6~12細胞,細胞碎片6%~15%,卵裂球均一性良。3級: 5~6細胞,細胞碎片<30%。4級: ≥6細胞,細胞碎片>30%或所有≤5細胞;5級: 2PN,未分裂胚胎或含有100%碎片的胚胎。1級、2級胚胎視為優(yōu)質(zhì)胚胎,1級、2級、3級胚胎為可移植胚胎。2PN(原核pronucleus, PN)形成率=2PN數(shù)/獲卵數(shù)×100%,可移植胚胎率=可移植胚胎數(shù)/2PN胚胎數(shù)×100%,優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/2PN胚胎數(shù)×100%
本研究共80例患者。不同年齡組比較,3組的不孕年限、基礎(chǔ)內(nèi)分泌雌二醇和孕激素相比,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);基礎(chǔ)內(nèi)分泌黃體生成素和卵泡刺激素不同年齡組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。
不同年齡組獲卵數(shù)差異有統(tǒng)計學意義,隨著年齡的增大,獲卵數(shù)逐漸減少。2PN形成率和優(yōu)質(zhì)胚胎率在不同年齡組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而可用胚胎率在不同年齡組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。
C組在取卵日的卵泡液CFTR水平(92.68±29.94)ng/mL]明顯高于A、B兩組取卵日的卵泡液CFTR水平(52.94±25.51)、(75.29±29.29)ng/mL];B組在取卵日的卵泡液CFTR水平高于A組,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);卵泡液中CFTR水平與年齡呈明顯正相關(guān)(r=0.497),見表1。
不同年齡組胚胎培養(yǎng)結(jié)局中獲卵數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎率與卵泡液中CFTR含量呈反比;2PN形成率與卵泡液中CFTR含量呈正比,見表1。
表1 患者的一般情況和卵子及胚胎發(fā)育結(jié)局
使用間接免疫熒光染色法檢測卵丘顆粒細胞上CFTR的表達,CFTR蛋白在卵丘顆粒細胞的胞質(zhì)和胞膜上均有表達,見圖1。
圖1 鏡下觀察顆粒細胞中CFTR的表達定位情況(免疫熒光染色)Fig.1 CFTR is located in the cytoplasm and cell membrane of cumulus granulosa cells圖示CFTR定位于卵丘顆粒細胞的細胞漿和細胞膜;實線箭頭為顆粒細胞;虛線箭頭為顆粒細胞團
4例不同年齡患者的卵丘顆粒細胞上均有一定量的CFTR mRNA表達;不同年齡患者卵丘顆粒細胞中CFTR mRNA表達與年齡呈正相關(guān)(r=0.440),但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.560),見表2。
不同年齡胚胎培養(yǎng)結(jié)局中獲卵數(shù)和可用胚胎率與年齡呈反比趨勢,可用胚胎率與CFTR mRNA表達量也呈反比趨勢,見表3。
表2 不同年齡患者卵丘顆粒細胞CFTR mRNA的表達
經(jīng)WHO預測,21世紀不孕癥將成為僅次于腫瘤和心腦血管病的第三大類疾病,不孕癥已成為世界范圍內(nèi)廣泛關(guān)注的問題。傳統(tǒng)的胚胎選擇根據(jù)胚胎的形態(tài)學參數(shù)進行評估,即依據(jù)細胞數(shù)量、碎片百分比及均一性篩選可移植胚胎,該方法因缺少客觀的可量化公認指標且受到實驗室技術(shù)人員主觀因素的影響,并不能準確反映胚胎的發(fā)育潛能。臨床研究發(fā)現(xiàn),超過30%可移植胚胎在著床期呈現(xiàn)“全”或“無”狀態(tài),而且同一患者不同周期胚胎種植率也不同。目前,尚缺乏可靠的無創(chuàng)性的胚胎選擇標志物。
表3 不同年齡患者卵丘顆粒細胞CFTR mRNA的表達與胚胎培養(yǎng)結(jié)局
研究證實,許多細胞因子參與卵母細胞及胚胎的正常發(fā)育,卵泡液是卵母細胞生長的微環(huán)境,是在卵泡發(fā)育早期,由血漿蛋白跨過血-卵屏障與卵泡周圍的顆粒細胞、卵母細胞和卵泡膜細胞分泌物共同累積到濾泡腔所構(gòu)成的卵泡中一種重要的動態(tài)組成成分。能否通過卵泡液的分析來預測卵子及胚胎的發(fā)育情況是目前研究的熱點。本研究分析了卵泡液CFTR與IVF/ICSI患者卵子及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)其在卵泡液中的濃度與患者的年齡、基礎(chǔ)內(nèi)分泌激素水平等因素之間的表達規(guī)律。目前已有許多研究發(fā)現(xiàn),與年齡相關(guān)的不孕癥,不僅與卵子質(zhì)量、子宮內(nèi)膜、陰道分泌物改變及女性健康水平的下降等因素有關(guān),同時還可能與卵泡液中某些相關(guān)蛋白質(zhì)的含量變化存在密切關(guān)系。Hashemitabar等發(fā)現(xiàn),不同年齡段女性的卵泡液蛋白質(zhì)中有十余種蛋白存在差異,相較于年輕女性,中年女性的卵泡液中,血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、血液結(jié)合素、激肽原-Ⅰ、補體C3和補體C4這五種蛋白的表達發(fā)生下調(diào)。本研究結(jié)果顯示,年齡≥40歲的患者在取卵日的卵泡液CFTR水平明顯高于其他兩組年輕患者取卵日的卵泡液CFTR水平,差異有統(tǒng)計學意義,研究同時發(fā)現(xiàn)卵泡液中CFTR水平與年齡呈明顯正相關(guān),年齡越大,卵泡液中CFTR水平越高。年齡不僅影響女性的卵巢功能和卵母細胞的質(zhì)量,還影響卵母細胞的發(fā)育,即隨著年齡的增加,卵母細胞發(fā)育異常的頻率也不斷增加,但機制尚未明確。卵泡液是卵母細胞賴以生存的微環(huán)境,測定卵泡液中CFTR含量具有簡便性和早期預測性,因此對卵泡液中CFTR的代謝評估可能為預測卵母細胞的質(zhì)量提供有價值的信息。
離子通道蛋白是影響液體微環(huán)境的重要調(diào)控因子。自20世紀80年代末CFTR基因被克隆以來,它一直是離子通道研究中的一個熱點,屬于ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ATP-binding Cassette transporter, ABC)家族。CFTR作為子宮中唯一的Cl-通道,控制著宮頸、宮腔的液體分泌。本研究結(jié)果顯示,年齡與卵泡液中CFTR水平呈正相關(guān),且卵泡液中高水平CFTR與該卵泡液的獲卵數(shù)有關(guān),表明隨著年齡增加,機體將過多合成分泌CFTR,可能影響卵泡中卵子的正常發(fā)育。有研究觀察到,CFTR抑制劑或者抗體的應(yīng)用會降低精子的獲能,同時動物實驗觀察到有CFTR突變小鼠的受精能力與正常小鼠相比明顯降低。本研究結(jié)果顯示,不同年齡組胚胎培養(yǎng)結(jié)局中2PN形成率與卵泡液中CFTR含量呈正相關(guān),這說明在胚胎形成早期微環(huán)境中的CFTR含量會影響卵母細胞的受精能力,這與已有的研究相符。但本研究觀察到可用胚胎率在卵泡液CFTR含量(52.94±25.51)~(75.29±29.29)ng/mL]內(nèi)呈遞增趨勢,在卵泡液CFTR含量(75.29±29.29)~(92.68±29.94)ng/mL]內(nèi)呈遞減趨勢,這說明在胚胎的發(fā)育過程中,早期微環(huán)境中適量的CFTR可促進胚胎的發(fā)育,但當CFTR的含量超過一定的范圍,可能會影響胚胎的進一步發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)內(nèi)分泌雌二醇水平與卵泡液中CFTR含量呈正相關(guān),CFTR含量隨著bE2水平的升高而增多。有研究顯示[10-12],CFTR的異常表達還與卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulation syndrome, OHSS)、輸卵管積水、沙眼衣原體感染所致的女性不孕等婦科疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切的聯(lián)系。Ajonuma等[10]發(fā)現(xiàn),給無孕激素對抗小鼠注射雌激素后,小鼠出現(xiàn)了OHSS樣癥狀,同時子宮和卵巢的CFTR表達增加。給予孕激素和抗CFTR藥物后,OHSS癥狀減輕,說明雌激素可促進CFTR的上調(diào)表達。血清中的雌激素水平普遍被認為是反映卵母細胞質(zhì)量的良好指標,卵泡液中雌激素水平隨著卵泡的生長而逐漸升高,雌激素能促進卵母細胞的成熟,不同大小卵泡液中雌激素的濃度不同,而雌激素影響CFTR的上調(diào)表達,由此推測CFTR的濃度在不同大小卵泡液中的濃度可能存在差異性,在進一步的研究中可選擇不同大小卵泡對其卵泡液中E2和CFTR的濃度和相關(guān)性進行分析。
卵丘顆粒細胞在卵泡發(fā)育、卵母細胞成熟和性激素分泌中有很重要的作用,它們通過縫隙連接傳遞信息,促進卵母細胞的成熟、排卵。分析卵丘顆粒細胞中基因表達的變化,可能與卵母細胞發(fā)育和成熟相關(guān),間接反映受精卵的發(fā)育能力。由于卵母細胞十分珍貴,因而通過研究卵丘顆粒細胞來間接研究卵泡和卵母細胞的發(fā)育是一個無創(chuàng)的、適合臨床開展的途徑。本研究只選取了其中4例患者ICSI后卵丘顆粒細胞標本來初步探索卵丘顆粒細胞CFTR表達與年齡的相關(guān)性及對ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局的影響趨勢,結(jié)果與卵泡液中表達結(jié)果一致。本研究結(jié)果所示CFTR主要表達在卵丘顆粒細胞胞漿和胞膜上。卵丘顆粒細胞中CFTR在基因水平表達與年齡可能存在一個正相關(guān)性,并有可能影響ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局,驗證這一結(jié)果仍需要在不同年齡組加大樣本量進行研究。CFTR在卵丘顆粒細胞的表達,可能影響卵母細胞的成熟和卵子的發(fā)育能力,進而與ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局有關(guān)。
綜上所述,本研究分析了卵泡液中CFTR與IVF/ICSI患者卵子及胚胎發(fā)育結(jié)局的關(guān)系,初步探討了卵丘顆粒細胞CFTR表達對ICSI助孕胚胎發(fā)育結(jié)局的影響,證實了年齡與卵泡液中CFTR水平的相關(guān)性。CFTR蛋白是否可以作為與年齡相關(guān)的不孕癥的生物標志還需要在未來研究中對其機制進行探究,需要進一步開展細胞實驗證實卵泡液中CFTR的細胞來源。同時證實了在胚胎形成早期,微環(huán)境中的CFTR含量會影響卵母細胞的受精能力,CFTR對于胚胎發(fā)育的影響仍需要增加樣本量進一步研究。在進一步的研究中,將對臨床隨訪一直追溯至妊娠結(jié)局,如臨床妊娠率、活產(chǎn)率等。期待可以發(fā)現(xiàn)CFTR更多生理病理方面的功能與作用,從而通過體外鑒定精確、簡便地預測輔助生殖的成功率,并改善臨床結(jié)局。