段曉穎，范梨穎，馬秋瑩，牛曉靜，郭 嬌，徐立然

(1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 ，河南 鄭州 450000； 2.河南中醫(yī)藥大學，河南 鄭州 450046； 3.商丘市中醫(yī)院，河南 商丘 476000)

靈芝為多孔菌科靈芝屬，又稱瑞草、靈芝草，是靈芝屬藥食兩用真菌，在我國已有2 000多年的藥用歷史，有補氣安神、止咳平喘的療效，常用于心神不寧、失眠心悸、肺虛咳喘、虛勞短氣等。此外，大量臨床應用表明靈芝還有抗腫瘤，保肝解毒，防治高血脂、中風、心血管疾病，抗衰老，抗神經(jīng)衰弱等功效[1-5]。研究表明：靈芝能夠刺激機體中淋巴細胞的轉化能力和吞噬細胞的吞噬能力，從而產(chǎn)生免疫調節(jié)作用[6-7]。本研究以靈芝中總三萜和靈芝酸A為考察指標，通過均勻設計和單因素實驗研究總三萜的最佳提取、純化工藝。

1 藥品、試劑與儀器

靈芝藥材，批號140203，產(chǎn)地安徽。熊果酸，純度為HPLC≥98%，中國食品藥品檢定研究院提供，批號110742-200517；靈芝酸A，純度為HPLC≥98%，成都普菲德生物技術有限公司產(chǎn)品，批號140324；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純。大孔吸附樹脂HPD400，滄州寶恩化工有限公司產(chǎn)品；Aglient 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司產(chǎn)品；TU-1800PC紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司產(chǎn)品；RE-5220旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；LXJ-ⅡB離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品；HK 250科導臺式超聲波清洗器，上海漢克科學儀器有限公司產(chǎn)品；Sartorius CP225D電子天平，德國賽多利斯公司產(chǎn)品。

2 方法與結果

2.1 靈芝總三萜提取工藝研究

2.1.1 靈芝酸A含量測定方法研究

色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈(A) 、0.2%磷酸水(B)，檢測波長 254 nm，柱溫 30 ℃，進樣量 10μL，流速 1.0 mL/min，信號采集時間 90 min。梯度洗脫程序為: 0-30 min, 33%～34% A；30-60 min, 34%～80% A；60-70 min, 80%～100% A；70-75 min, 100%～33% A；75-90 min， 33% A。

對照品溶液的制備：精密稱取靈芝酸A對照品 10.06 mg，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取靈芝粉末1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入乙醇 50 mL,稱定質量?；亓魈崛?60 min，放冷后稱量，乙醇補足差重。濾過，取續(xù)濾液，即得。

靈芝酸A標準曲線的繪制：精密量取質量分數(shù)為1.006 g/L的對照品儲備液0.05,0.10,0.25,0.50,0.75,1.00,1.25 mL置于5 mL 的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按照上述色譜條件進樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標，進樣量(μL)為橫坐標繪制標準曲線。經(jīng)計算得回歸方程為y=900.76x+5.073 0,r=0.999 7。結果表明：靈芝酸A峰面積和含量在0.100 6～2.515 0 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

含量測定：取供試品和對照品各10 μL按色譜條件進樣，記錄各樣品中靈芝酸A峰面積，計算靈芝酸A百分含量。

2.1.2 總三萜含量測定

參照2015版《中國藥典》。

對照品溶液的制備：精密稱取熊果酸對照品2.13 mg，加無水乙醇稀釋至10 mL，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取靈芝粉末約1g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入乙醇50 mL, 稱定質量；回流提取 60 min，放冷后稱量質量；乙醇補足減失質量；濾過，取續(xù)濾液，即得。

熊果酸標準曲線的繪制：分別精密量取對照品溶液0.2 ，0.3，0.4，0.6，0.8 mL，置10 mL的具塞試管中；水浴蒸干；加 0.4 mL質量分數(shù)為50 g/L 香草醛-冰乙酸溶液和1.0 mL的高氯酸溶液，搖勻；65 ℃水浴 45 min；取出，立即放入冰水浴中；加入5.0 mL 冰乙酸溶液，搖勻后放置；15 min后以相應試劑為空白，在 548 nm 處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，熊果酸濃度為橫坐標繪制標準曲線。經(jīng)計算得回歸方程為：Y=30.009X+0.099 6,r=0.999 5。結果表明：吸光度和熊果酸在0.006 7～0.026 6 g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關系。

含量測定：精密量取供試品溶液 0.5 mL，同對照品的測定方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算總三萜含量。

2.1.3 靈芝提取次數(shù)考察

準確稱取靈芝粉末 30.0 g，加入10倍量體積分數(shù)為 850 mL /L的乙醇，提取 3 次，每次 2 h，以總三萜轉移率為指標，考察提取次數(shù)對總三萜提取量的影響。結果顯示：提取1次、2次、3次,總三萜轉移率依次為65.52%、75.45%、83.31%。因此選擇提取次數(shù)為3次。

2.1.4 均勻實驗優(yōu)選提取工藝

表1 總三萜提取工藝均勻設計因素水平表

表2 總三萜提取均勻設計實驗安排表及實驗結果

根據(jù)指標對提取目的重要性程度，給予不同的權重系數(shù)，總三萜為0.6，靈芝酸A為0.4，再進行加權求和，綜合評分以各指標的轉移率來計算。利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行回歸分析，根據(jù)各回歸方程的回歸系數(shù)、F值及其顯著性檢驗，選出最優(yōu)方程：Y=74.052+0.216X1-0.026X1X2+0.001X1X3+0.014X2X3-0.001X3。顯著水平P=0.004，相關系數(shù)R=0.998，調整后相關系數(shù)R=0.994。表明該回歸方程擬合度良好，因素顯著。對該回歸方程進行規(guī)劃求解，優(yōu)選的最佳工藝為：加體積分數(shù)為 900 mL /L的乙醇 8 倍量，提取 100 min。

2.1.5 最佳工藝的驗證

稱取靈芝粗粉 3 份，每份 100 g，按照最佳提取工藝提取，測定提取液中總三萜和靈芝酸A含量，計算轉移率。結果：該工藝條件下總三萜的轉移率分別為91.82%、89.19%、89.49%，平均轉移率為90.17%；靈芝酸A的轉移率分別為86.37%、87.10%、83.73%，平均轉移率為85.73%。加權處理后平均轉移率為88.39%，大于規(guī)劃求解推薦值84.97%，說明該提取工藝穩(wěn)定性較好。

2.2 靈芝總三萜大孔樹脂純化工藝研究

2.2.1 均勻實驗優(yōu)選上樣工藝

均勻設計因素水平表：以吸附率為考察指標，分別考察上樣液質量分數(shù)(g/L)、上樣流速(mL/min)、上樣液pH值和徑高比4個因素對總三萜純化的影響，因素水平表見表3。

表3 總三萜純化均勻設計因素水平表

供試液的制備：稱取靈芝藥材粗粉 300 g，按照上述最佳提取工藝進行提取，合并提取液，減壓濃縮，用乙醇配制不同上樣液，按照U9(95)均勻實驗安排表進行上樣，收集流出液，按 2.1.2項下方法測定吸附后溶液中總三萜含量，計算吸附率%。結果見表4。

表4 均勻設計安排表及結果

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行回歸分析，選出最優(yōu)方程為：Y=174.884-5.311X1-0.679X3-3.448X4+0.799X1X2+0.166X1X4-3.271X2X2。顯著水平P=0.004，相關系數(shù)r=0.999，調整后相關系數(shù)r=0.994。表明該回歸方程擬合度良好，對該方程規(guī)劃求解，優(yōu)選的最佳工藝為：上樣液質量分數(shù)10.52 g/L，上樣流速1.0 mL/min，上樣液pH值為8，徑高比1∶11。

2.2.2 最佳上樣工藝的驗證

按照上述優(yōu)選出的工藝參數(shù)平行3份進行驗證試驗，結果吸附率分別為99.36%、99.41%、99.39%，RSD值為0.03%，表明工藝穩(wěn)定性良好。

2.2.3 泄露曲線

取已處理好的HPD-400大孔吸附樹脂濕法裝柱，使徑高比為1∶11，取質量分數(shù)為10.52 g/L，pH=8的上樣液上樣，控制上樣流速為 1.0 mL/min，分段收集洗脫柱液。每 10 毫升收集1份，共收集20份，測定接收液中總三萜質量分數(shù)，以上樣體積為橫坐標，泄露率為縱坐標繪制泄露曲線，結果見圖1。

圖1 泄露曲線

從第7份接收液開始已經(jīng)有總三萜泄露，但此時泄露率僅為1.98%，相對于上樣量仍然很小，至第12份接收液泄露液質量分數(shù)急劇增大，因此選擇泄露液濃度急劇增大前上樣，即110 mL。

2.2.4 洗脫工藝優(yōu)選

洗脫流速考察：按上述確定的吸附條件，取上樣液分別通過3根相同的HPD-400樹脂柱，進行動態(tài)吸附，用3 BV的乙酸乙酯分別以1.0 ，2.0 ，3.0 mL/min的洗脫流速進行洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總三萜含量，計算解吸率。結果見圖2。

圖2 總三萜純化洗脫流速考察曲線

洗脫曲線：按照上述所確定的吸附和洗脫條件，進行上柱、吸附和洗脫，每25毫升收集 1 份，連續(xù)接取洗脫液。對每份洗脫液進行測定，以流出液體積為橫坐標，以每份中總三萜的解吸率%為縱坐標，繪制洗脫曲線，結果見圖3。

圖3 洗脫曲線

由圖3可看出，當洗脫劑用量為 150 mL時，洗脫液中總三萜解吸率已接近為零，總三萜已幾乎被洗脫下來，因此確定洗脫劑用量為150 mL，即3.4 BV。

2.2.5 總三萜最佳工藝驗證

按照上述篩選的工藝進行上樣吸附和解吸，收集流出液，測定總三萜含量。結果顯示：3次含量分別為54.80%、53.95%、55.78%，平均含量為54.84%，達到50%以上，該工藝穩(wěn)定、可行。

3 討 論

在預實驗中，比較HPD-100、HPD-300、HPD-400、HPD-600、D101、AB-8、X-5、HPD-BJQH、S-8樹脂對靈芝三萜的純化，結果顯示：D101、 HPD-400、 AB-8、X-5這4種非極性或弱極性樹脂的吸附率和比吸附量均較大。通過對該4種樹脂進行靜態(tài)吸附、解吸動力學考察，結果顯示：HPD-400型大孔樹脂的吸附率和解吸率最高，且在2 h左右達到吸附平衡，較其他樹脂更早達到飽和吸附，縮短吸附時間。因此，選擇HPD-400作為總三萜純化用樹脂。

在總三萜的純化工藝研究中，大都采用水溶液進行上樣吸附，而三萜屬脂溶性成分，靈芝三萜提取濃縮液加水溶解后出現(xiàn)沉淀，不易被大孔樹脂吸附，損失較大，上樣液用900 mL/L乙醇配制。在選擇洗脫劑時,對非極性樹脂,要求采用對化合物有較好溶解度且要有較好的極性,這樣可得到高濃度的洗脫液,常用的溶劑是水、低級醇、丙酮、乙酸乙酯等,由于上樣吸附時采用的溶劑是 900 mL/L 乙醇,因此采用比乙醇極性低的溶劑如丙酮、乙酸乙酯進行解吸,兩者都具有較好的解吸能力,但丙酮為易制毒試劑，故選擇乙酸乙酯為洗脫劑進行洗脫[10-12]。