，，

近年來，以動(dòng)脈硬化閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎和糖尿病足為主的下肢缺血性疾病嚴(yán)重困擾著人們的健康，由組織代謝量與維持生命活動(dòng)的氧氣需求量之間不平衡所導(dǎo)致。血管新生技術(shù)的出現(xiàn)，為建立有效的側(cè)支循環(huán)，改善下肢缺血狀態(tài)開辟了新途徑。中醫(yī)藥憑其多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)，治療下肢缺血性疾病前景廣闊。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎大鼠下肢股動(dòng)脈制造下肢缺血模型，探討芪芍復(fù)脈湯對(duì)促進(jìn)缺血下肢血管新生的作用及其機(jī)制，以期為芪芍復(fù)脈湯的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠下肢缺血模型的建立 SD大鼠108只，雄性，6月齡，體質(zhì)量250 g～300 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(軍)2014-0004。常規(guī)飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為模型組(90只)和假手術(shù)組(18只)。大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)麻醉，選左側(cè)腹股溝中點(diǎn)向膝部作一長(zhǎng)度約2 cm的縱向切口，緊貼腹股溝下方分離股動(dòng)脈主干，行股動(dòng)脈結(jié)扎、離斷及分支剔除術(shù)，制造下肢缺血模型。假手術(shù)組僅暴露股三角，不結(jié)扎動(dòng)脈及其分支，術(shù)后大鼠下肢肌肉注射抗青霉素(8 U)，連續(xù)3

d，預(yù)防感染。

1.2 動(dòng)物分組 將造模成功的大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，模型組18只，芪芍復(fù)脈湯高劑量組18只，中劑量組18只，低劑量組18只，粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)組18只。

1.3 給藥方法 芪芍復(fù)脈湯組方：黃芪30 g，當(dāng)歸15 g，桂枝15 g，麥冬10 g，赤芍15 g，川芎10 g，三七3 g，丹參30 g，土元6 g，全蝎6 g，川牛膝30 g，甘草6 g。廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)顆粒劑，1 g顆粒折合生藥量4.5 g ，根據(jù)藥物的溶解性確定最大給藥濃度，以此作為高劑量給藥濃度，0.50倍為中劑量給藥濃度，0.25倍為低劑量給藥濃度。給藥劑量為：高劑量組7.6 g/(kg·d)，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的12倍；中劑量組3.8 g/(kg·d)，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的6倍；低劑量組1.9 g/(kg·d)，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的3倍，加溫開水至10 mL，1 mL/100 g；模型組和假手術(shù)組灌服蒸餾水，1 m L/100 g，每天1次，連續(xù)14 d。

陽性對(duì)照藥：應(yīng)用rhG-CSF 200 μg /1.2 mL， 購(gòu)自山東齊魯制藥有限公司，批號(hào)S19990049。用生理鹽水稀釋至12 mL 備用，予rhG-CSF組大鼠患肢皮下注射，注射量0.21 mL/100 g，相當(dāng)于60 kg體重成人用量的7倍， 每日1次，連續(xù)5 d。

1.4 主要試劑與儀器 一抗(VEGF)購(gòu)自英國(guó)abcam公司，貨號(hào)：ab52917；二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)購(gòu)自丹麥DAKO公司，貨號(hào)：K5007；CD34抗體，購(gòu)自英國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab8158 ；組化試劑盒DAB顯色劑購(gòu)自丹麥DAKO公司，貨號(hào)：K5007。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 術(shù)后3 d、7 d、14 d，各組取6只大鼠，用免疫組化方法檢測(cè)大鼠患側(cè)內(nèi)收肌毛細(xì)血管密度(MVD)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)。

1.5.1 缺血骨骼肌中毛細(xì)血管密度測(cè)定 石蠟包埋，切片后脫蠟，EDTA抗原修復(fù)緩沖液修復(fù)抗原，待自然冷卻后，用3%過氧化氫溶液溫室避光孵育25 min，用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，滴加一抗，4 ℃孵育過夜， PBS 緩沖液洗滌 5 min共3次，滴加二抗體，室溫37 ℃孵育20 min，PBS 緩沖液洗滌5 min共3次，DAB顯色，復(fù)染、封片。進(jìn)行400倍的顯微照相。

1.5.2 缺血骨骼肌VEGF蛋白表達(dá)測(cè)定 石蠟包埋、切片后脫蠟，EDTA抗原修復(fù)緩沖液修復(fù)抗原，自然冷卻后，用3%過氧化氫溶液溫室避光孵育25 min，用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min，加一抗VEGF后4℃孵育過夜， PBS 緩沖液洗滌5 min共3次，滴加二抗(HRP山羊抗兔鼠通用)，室溫孵育50 min，再用PBS 緩沖液洗滌 5 min共3次，滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察2 min，沖洗切片終止顯色，復(fù)染細(xì)胞核，脫水，封片。400倍顯微鏡鏡檢，每張切片選擇 6個(gè)視野，應(yīng)用圖像采集分析系統(tǒng)計(jì)算光密度值，取均值作為VEGF的蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，不同處理因素不同時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，如果存在交互作用，分析各因素的單獨(dú)效應(yīng)；如果無交互作用，則分析各因素的主效應(yīng)。LSD法進(jìn)行組間比較。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠下肢缺血模型建立情況 結(jié)扎、離斷大鼠下肢股動(dòng)脈及其分支的造模效果顯著，除假手術(shù)組外，其余各組均有不同程度的活動(dòng)障礙，6組大鼠下肢未見壞死。

2.2 各組MVD值比較 術(shù)后3 d，各組間MVD值無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后7 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復(fù)脈湯高劑量組、芪芍復(fù)脈湯中劑量組較模型組與低劑量組比較上升(P<0.05或P<0.01)，rhG-CSF組與高劑量組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后14 d，各組間總體不全相同，rhG-CSF組、芪芍復(fù)脈湯高劑量組較模型組和低劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中劑量組較模型組升高(P<0.05)，并且高劑量組高于中劑量組(P<0.05)，高劑量組與G-CSF組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)MVD值比較(±s)

圖1 各組MVD免疫組化圖

2.3 各組VEGF蛋白表達(dá)比較 假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；術(shù)后3 d，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組、G-CSF組VEGF光密度值較模型組升高(P<0.01)，高劑量組較低劑量組升高(P<0.01)，中劑量組較低劑量組升高顯著(P<0.05)；術(shù)后7 d，模型組較假手術(shù)組VEGF光密度值升高(P<0.05)，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組和G-CSF組較模型組升高(P<0.01)，其中G-CSF組較高劑量組升高(P<0.05)，高劑量組較低劑量組升高顯著(P<0.05)；術(shù)后14 d，高、中劑量組和G-CSF組較模型組升高顯著(P<0.05或P<0.01)，并且高劑量組高于中劑量組(P<0.05)，中劑量組高于低劑量組(P<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間VEGF蛋白表達(dá)(±s)

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的肝素結(jié)合蛋白，由不同長(zhǎng)度、形態(tài)和酸堿度的氨基酸構(gòu)成。在血管生成和側(cè)支循環(huán)構(gòu)建過程中，依賴相關(guān)生長(zhǎng)因子，發(fā)揮調(diào)控作用。研究表明VEGF可特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂[1]，有強(qiáng)烈的促血管生成作用。其起作用的方式主要有3方面[2-4]：①它可以直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，特異性地與血管內(nèi)皮上的特殊受體相結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，從而促進(jìn)血管新生；②通過招募骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)向外周血遷移、歸巢、整合于受損血管叢，進(jìn)而分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管新生。Takah等[5]給予缺血大鼠外源性的VEGF，從而升高外周血中 EPCs 的數(shù)量，就是利用VEGF的這一作用促進(jìn)了血管再生。③VEGF具有高通透性，因此也叫血管滲透因子[3]，它可以通過增加微血管的通透性，使血液內(nèi)的血漿蛋白滲透致血管外，大量的纖維蛋白原凝固成纖維蛋白，作為內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等暫時(shí)的基質(zhì)成分，并促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增殖，最終促進(jìn)血管的生成。毛細(xì)血管密度是檢測(cè)血管新生的重要指標(biāo)[6]，它反映血管再生能力的強(qiáng)弱，即MVD的值越高，代表新生毛細(xì)血管越豐富。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：術(shù)后14 d，芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組增加了缺血骨骼肌局部毛細(xì)血管密度，并且顯著高于模型組，意味著芪芍復(fù)脈湯能夠促進(jìn)下肢缺血大鼠模型的血管新生。實(shí)驗(yàn)中芪芍復(fù)脈湯高、中劑量組與模型組和假手術(shù)組相比，VEGF 的光密度值顯著上調(diào)，證明芪芍復(fù)脈湯能通過上調(diào)促血管新生因子蛋白的表達(dá)，提高缺血下肢微血管密度，促進(jìn)缺血下肢側(cè)支循環(huán)的形成，促進(jìn)血管新生。

大量的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，中藥相對(duì)西藥具有多靶點(diǎn)、多途徑的治療優(yōu)勢(shì)，很多中藥具有促血管新生的作用[7]。血管新生是近年提出的概念，然而早在幾千年前中醫(yī)學(xué)中就有記載：“夫脈者，血之府也?！薄鹅`樞·經(jīng)水》載：“若夫八尺之士，皮肉在此，外可度量切循而得之，其死可解剖而視之……脈之長(zhǎng)短……皆有大數(shù)”。說明中醫(yī)所述的“脈”和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“血管”名異而實(shí)同，無論從形態(tài)結(jié)構(gòu)還是功能上都相對(duì)應(yīng)。從古至今，大部分醫(yī)家認(rèn)為下肢缺血性疾病的基本病機(jī)為氣血瘀滯，經(jīng)絡(luò)阻塞，陽氣不能達(dá)于四末。在下肢缺血性疾病的治療上把活血化瘀方法貫穿始終，然而形成瘀血的病因方面歷代醫(yī)家卻眾說紛紜。吾師李廷荃教授認(rèn)為，下肢缺血性疾病的發(fā)病以中老年人為主，年過半百，其天葵衰，正氣虧虛，所以氣血虧虛是導(dǎo)致疾病發(fā)生的主要原因?，F(xiàn)代研究證明陰虛病人的血液黏稠度、紅細(xì)胞沉降率、纖維蛋白原含量均高于正常人[8]。陰虛可以導(dǎo)致血液運(yùn)行遲緩，形成瘀血，所以陰虛是缺血性疾病發(fā)病的重要因素。吾師認(rèn)為治療此病，當(dāng)以益氣活血、滋陰復(fù)脈為治療大法。

芪芍復(fù)脈湯是李廷荃教授經(jīng)過多年臨床實(shí)踐，反復(fù)探索與完善總結(jié)出的治療下肢缺血性疾病的效驗(yàn)方。方中黃芪補(bǔ)氣，培正固本，使氣旺則血行；赤芍活血散瘀；麥冬養(yǎng)陰增液，使陰血充、脈絡(luò)盈；三藥共為君，奏益氣活血、滋陰復(fù)脈之功。桂枝助陽化氣，溫通經(jīng)脈，發(fā)越陽氣，溫養(yǎng)肌膚；三七、川芎、丹參、川牛膝活血祛瘀、行氣止痛，助赤芍活血化瘀，與桂枝共為臣；當(dāng)歸養(yǎng)血補(bǔ)血，助麥冬養(yǎng)陰增液；土元、全蝎借其行散走竄之力，搜風(fēng)通絡(luò)止痛與當(dāng)歸共為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，解土元、全蝎之毒性，為使。全方養(yǎng)陰血以增津液，活血化瘀以通脈絡(luò)，使正氣壯，瘀血除，新血生，血供改善，從而減輕肢體不適癥狀。

本實(shí)驗(yàn)得出：芪芍復(fù)脈湯不同劑量組與模型組比較均有差異，并且術(shù)后14 d高劑量組VEGF光密度值和MVD值均顯著高于中劑量組和低劑量組，中劑量組顯著高于低劑量組，說明芪芍復(fù)脈湯對(duì)下肢缺血大鼠模型的治療存在劑量依賴性，為臨床治療下肢缺血性疾病提供了劑量指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

芪芍復(fù)脈湯能夠促進(jìn)缺血大鼠下肢骨骼肌毛細(xì)血管密度的增多，促進(jìn)血管新生，其機(jī)制可能與促進(jìn)缺血組織VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。芪芍復(fù)脈湯能否動(dòng)員骨髓中的EPCs，能否增加缺血組織中CD34陽性細(xì)胞的含量，還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。