王艷 郝爽 王文思 韓一楠 方興 姚文清

110005沈陽,遼寧省疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃所(王艷、郝爽、王文思、方興、姚文清);116021大連市疾病預(yù)防控制中心免疫規(guī)劃所(韓一楠)

麻疹是由麻疹病毒(measles virus，MV)引起的急性呼吸道傳染病，臨床以發(fā)熱伴出疹為主要癥狀。2010年12月，世界衛(wèi)生組織(world health organization，WHO)消除麻疹定義為:麻疹監(jiān)測系統(tǒng)(measles surveillance system，MSS)運轉(zhuǎn)良好的前提下，明確的地理區(qū)域內(nèi)無本土麻疹病毒傳播≥12個月[1]。因此病毒基因型的基線調(diào)查是做好麻疹消除工作的前提。近20年的監(jiān)測顯示遼寧省流行的麻疹野病毒基因型均為H1a[2]。2018年5月，遼寧省首次在大連1例麻疹患者的咽拭子標(biāo)本中分離并鑒定出D8基因型病毒。

1 材料與方法

1.1 病例來源 該病例相關(guān)信息均來自遼寧省MSS。

1.2 標(biāo)本采集、運送和初步篩查 按照全國麻疹監(jiān)測方案要求，采集病例咽拭子和血標(biāo)本并運送到市級麻疹實驗室進(jìn)行檢測。血標(biāo)本用ELISA法同時檢測麻疹和風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體；提取咽拭子中的病毒核酸并使用熒光PCR法檢測麻疹和風(fēng)疹病毒核酸。按照遼寧省麻疹網(wǎng)絡(luò)實驗室要求，對核酸篩查陽性的咽拭子標(biāo)本在10日內(nèi)上送至省疾病預(yù)防控制中心分離病毒和基因分型。

1.3 病毒分離 按照《麻疹診斷》WS 296—2017附錄B.1處理標(biāo)本并將標(biāo)本接種至單層Vero/Slam細(xì)胞，逐日觀察細(xì)胞是否產(chǎn)生病變(CPE)。如出現(xiàn)麻疹病毒典型的融合CPE可連續(xù)傳至3代后收獲，3代后仍無CPE的視為陰性棄去。

1.4 毒株鑒定 使用RT-PCR方法對收獲的毒株進(jìn)行鑒定。使用Qiagen公司 One-Step RT-PCR Kit擴(kuò)增MV H基因全長和N基因羧基末端的676個核苷酸。實驗條件及引物序列參照文獻(xiàn)[3]。

1.5 序列分析 將PCR產(chǎn)物送北京Invitrogen生物技術(shù)有限公司測序。將返回序列與WHO MV 24個基因型的參考株序列，使用MEGA 5.0軟件分別對H基因和N基進(jìn)行核苷酸和氨基酸的變異比對分析，并構(gòu)建基因親緣關(guān)系進(jìn)化樹。

2 結(jié) 果

2.1 病例的流行病學(xué) 病例為男性，1983年出生，大連市戶籍，待業(yè)。2018年4月30日出現(xiàn)發(fā)熱和呼吸道卡他癥狀，5月1日出現(xiàn)皮疹，臨床診斷為麻疹并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)直報?；颊卟磺宄欠窠臃N過麻疹疫苗，發(fā)熱前7～21 d無外出史，無醫(yī)院就診史，與明確感染出疹性疾病患者無接觸史。

2.2 血清麻疹、風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體檢測和咽拭子核酸檢測 麻疹I(lǐng)gM抗體和病毒核酸均為陽性，風(fēng)疹I(lǐng)gM抗體和病毒核酸均為陰性。該病例為麻疹實驗室確診病例。

2.3 病毒分離、復(fù)核和標(biāo)準(zhǔn)命名 接種咽拭標(biāo)本的細(xì)胞于第一代就出現(xiàn)了典型的融合病變，轉(zhuǎn)種至3代后收獲病毒。該病毒序列經(jīng)國家麻疹參比實驗室復(fù)核并確認(rèn)為D8基因型。按照WHO麻疹野病毒的標(biāo)準(zhǔn)命名方法，將該麻疹病毒分離株命名為:MVi/Liaoning.CHN/18.18/1。

2.4 D8基因型確定 將遼寧省D8基因型麻疹病毒與WHO 24個基因型參考株、GenBank上下載的北京、香港的D8基因型麻疹病毒流行株和2017—2018年麻疹病毒D8基因型其他國家流行株基于N基因羧基端450個核苷酸序列構(gòu)建基因親緣關(guān)系進(jìn)化樹(圖1)。MVi/Liaoning.CHN/18.18/1麻疹野病毒與WHO D8基因型麻疹病毒參考株MVi/Manchester.GBR/30.94/D8最為接近，其 Bootstrap值為98.9%。該分離株屬于D8基因型。

2.5 遼寧D8基因型麻疹病毒分離株H和N基因變異分析 遼寧株與WHO D8基因型參考株Manchester.GBR/30.94 N基因核苷酸和氨基酸同源性分別為98.9%和97.3%；H基因核苷酸和氨基酸同源性均為98.9%。與中國優(yōu)勢流行H1參考株Hunan.CHN/93/7 N基因核苷酸和氨基酸同源性分別為92.4%和91.3%，H基因核苷酸和氨基酸同源性分別為93.8%和95.8%(表1)。

3 討 論

麻疹病毒基因型別分布具有明顯的地理特征，并且野病毒流行與年代存在一定的相關(guān)性[4]。D8基因型麻疹病毒主要流行于印度、孟加拉等南亞國家，美國和澳大利亞近年來也多次監(jiān)測到D8基因型的流行。中國首例輸入性D8基因型麻疹病例由上海市疾病預(yù)防控制中心于2012年報道[5]。2013年在北京出現(xiàn)2起由D8基因型麻疹病毒感染引起的暴發(fā)疫情，2016年之后又在廣東、湖北、內(nèi)蒙古、云南和安徽等省出現(xiàn)D8病毒的傳播(GenBank上未獲得相應(yīng)序列資料)。經(jīng)分析遼寧省此次D8基因型病毒與GenBank上傳的中國香港2012—2016年流行序列100%同源，與2018年在哥倫比亞分離的MVi/LosPatios.COL/11.18/D8序列同源性為100%。與2013年北京流行的D8基因型麻疹病毒處于不同的分支。

圖1 遼寧省D8基因型麻疹病毒分離株與WHO各基因型參考株構(gòu)建的基因親緣性關(guān)系樹D8 genotype strains of China；2017-2018 D8 genotype strains from other countries；WHO D8 genotype strain；Liaoning isolateFig.1 The phylogenetic tree of Liaoning D8 strains compared to the WHO reference strains for each genotype

自患者確診為麻疹后經(jīng)過1個麻疹最長的潛伏期，未發(fā)現(xiàn)2代病例，大連麻疹疫情平穩(wěn)。H基因變異分析顯示，該D8麻疹病毒分離株與疫苗株S191相比在重要抗原位點變異程度與遼寧H1分離株相似，結(jié)合流行病學(xué)信息表明通過疫苗接種或者自然感染本土H1a基因型麻疹病毒后，體內(nèi)產(chǎn)生的抗體對阻斷D8基因型病毒的擴(kuò)散和傳播起一定作用。

遼寧D8基因型毒株與2016年于安徽和上海流行的D8基因型麻疹病毒同源性均為100%(國家麻疹實驗室未發(fā)表數(shù)據(jù))，因此推測D8基因型有可能已經(jīng)在我國呈現(xiàn)小范圍流行，該推測還需要綜合分析全國麻疹病毒學(xué)監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步研究加以證實。隨著我國本土H1基因型麻疹病毒傳播的減少，非本土基因型麻疹野病毒的輸入就會凸顯，越來越多的病毒基因型輸入引起的病例就會被監(jiān)測到。需要加強(qiáng)流行病學(xué)和實驗室監(jiān)測，密切追蹤D8基因型麻疹病毒在我國的流行態(tài)勢，以便采取有效措施及時阻斷該病毒在我國的進(jìn)一步轉(zhuǎn)播。

表1 遼寧省D8基因型麻疹病毒分離株與24個WHO不同基因型參考株N和HN基因平均遺傳距離Tab.1 N and H mean p-distances for nucleotides and amino acids for measles viruses D8 isolated of Liaoning province with WHO 24 genotype representative strains

利益沖突 無