李凱龍 田 芳 王達(dá)能 鄧樹華 陳 甜 吳樹會 周劍宇

(湖南省糧油產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測中心1，長沙 410201)

(郴州市食品藥品檢驗檢測中心2，郴州 410201)

谷物是全世界范圍內(nèi)最重要的主食之一，其中88%的消費(fèi)量和77%的出口集中在亞洲地區(qū)。根據(jù)2016年國際糧農(nóng)組織(FAO)的統(tǒng)計，近年來谷物產(chǎn)量穩(wěn)步增長，糙米產(chǎn)量也突破了49 520萬t［1］。因亞熱帶－熱帶地區(qū)適宜的溫濕度條件有利于真菌生長和真菌毒素的污染，使得亞洲地區(qū)谷物真菌毒素安全尤為突出。黃曲霉毒素是黃曲霉菌和寄生曲霉菌在生長過程中產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物，在糧食和食品中的主要存在形式包括黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及 M2等，其中 AFB1的毒性和致癌性最強(qiáng)［2］。所以許多國家和組織制定了食品和飼料中AFB1的最高限量，歐盟規(guī)定谷物中AFB1的含量不能超過2 μg/kg，AFs的總量不得超過 4 μg/kg［3］，我國最新國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017中規(guī)定玉米及其制品中AFB1的限量為20μg/kg，稻谷、糙米和大米中AFB1的限量為10μg/kg，小麥、大麥及其他谷物中AFB1的限量為5μg/kg。隨著谷物消耗量的不斷增加，即使是低劑量AFs的潛在污染都會對消費(fèi)者造成風(fēng)險。從田間到倉庫的不同環(huán)節(jié)都可能發(fā)生由產(chǎn)毒真菌引起的腐敗，這取決于一系列相互作用的生物和非生物因素［4－5］。水分活性(aw)是食品質(zhì)量控制中的一個重要指標(biāo)。通過利用水分活性可以控制食品微生物的污染，因此，在考慮一種食品的質(zhì)量與微生物腐敗之間的關(guān)系時，水分活性是極其有用的［6］。研究表明大多數(shù)細(xì)菌在水分活度0.91以下停止生長，大多數(shù)霉菌在水分活度0.8以下停止生長［7］。所以谷物水分活度對于儲藏期谷物的微生物安全至關(guān)重要。前人關(guān)于稻谷在儲藏過程中的霉變研究主要集中在不同水分含量稻谷的霉變規(guī)律和霉變防控技術(shù)［8－11］，而關(guān)于稻谷水分活度與霉變關(guān)系的研究以及稻谷和糙米在儲藏過程中的霉變風(fēng)險差異研究較少。本研究旨在通過在實驗室對稻谷和糙米接種高產(chǎn)毒黃曲霉菌孢子來模擬黃曲霉菌污染過程，比較不同儲藏溫度條件下:1)不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中呼吸速率和CO2總產(chǎn)量的差異;2)不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失(DML)的差異;3)不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中AFB1累積水平的差異。為稻谷儲藏過程中儲存形式和水分活度的選擇提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

稻谷:2017年產(chǎn)早秈稻，來自湖南長沙霞凝國家糧食儲備庫，初始水分14.2%;黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株NRRL3357為標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)黃曲霉毒素菌株;AflaStarTMR免疫親和柱:美國Romer公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

安捷倫6890N氣相色譜儀、安捷倫1260Infmity高效液相色譜儀(配有熒光檢測器和柱溫箱):美國Agilent公司;JLG－Ⅱ型礱谷機(jī):中儲糧成都糧食儲藏科學(xué)研究所;水分活度儀:美國 AquaLAB公司;DHG－9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱:上海培因?qū)嶒瀮x器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 谷物樣品與等溫吸濕曲線的繪制

首先在25℃條件下利用美國AquaLAB公司的水分活度儀測定同一批稻谷和糙米的初始水分活度。將已知不同體積的去離子水加入到裝有5 g谷物樣品的25 mL樣品瓶中，樣品瓶密封后再在4℃條件下平衡48 h，期間不斷振蕩搖勻。然后將樣品置于25℃平衡后測定水分活度，吸濕樣品通過在125℃烘箱中烘干再次稱量樣品干重計算得到其對應(yīng)的含水量。最后利用水分活度和含水量數(shù)據(jù)繪制成同一批稻谷和糙米的等溫吸濕曲線，具體方法參照文友先等的方法［12］。

1.3.2 真菌分離和高產(chǎn)毒黃曲霉菌的鑒定和篩選

分離程序:取霉變稻谷粒利用1%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒1 min，清水沖洗30 s，在濾紙上吸干水分后置于麥芽汁瓊脂(MEA)培養(yǎng)基和氯硝胺18%甘油(DG18)瓊脂培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基設(shè)置5個重復(fù)，每個培養(yǎng)皿中培養(yǎng)5粒稻谷粒或糙米粒。用無菌鑷子將稻谷粒和糙米粒等距擺放在MEA和DG18培養(yǎng)基上并在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。將黃曲霉菌單菌落再接種到MEA和DG18培養(yǎng)基上，用以確認(rèn)和隨后篩選高產(chǎn)毒黃曲霉菌。

黃曲霉毒素的定性測定:利用椰子瓊脂培養(yǎng)基篩選黃曲霉毒素是參考Davis等［13］的方法。培養(yǎng)基制備:將250 mL椰子脂和250 mL去離子水在75℃熱攪拌器中混勻后加入10.0 g瓊脂粉和0.08 g氯霉素，培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后倒入9 cm培養(yǎng)皿中冷卻備用。用無菌接種環(huán)將每種黃曲霉菌株的孢子懸浮液接種到培養(yǎng)平板上。接種過的培養(yǎng)皿在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，在激發(fā)光波長為365 nm的紫外光照射下觀察是否存在黃曲霉毒素的特有的藍(lán)色熒光，其中B族產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，G組產(chǎn)生黃綠色熒光［14］。陽性對照為黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株NRRL3357。

AFB1的定量分析參照GB 5009.22—2016方法進(jìn)行。定量分析結(jié)果用于篩選高產(chǎn)毒黃曲霉菌株。

1.3.3 稻谷和糙米感染黃曲霉菌孢子

為了加快谷物霉變速度，本研究在實驗室條件下通過接種篩選得到的高產(chǎn)毒黃曲霉菌孢子模擬谷物霉變過程。在培養(yǎng)10 d的高產(chǎn)毒菌株培養(yǎng)平板中加入含0.01%吐溫80的無菌水至覆蓋整個培養(yǎng)平板，用無菌玻璃棒攪勻培養(yǎng)基表面制備得到黃曲霉菌孢子懸浮液(每個樣品制備100μL)。利用血球計數(shù)器計數(shù)后，孢子懸浮液用無菌水調(diào)節(jié)孢子溶度為104/mL，也即102個孢子/g樣品。預(yù)先調(diào)節(jié)到設(shè)定水分活度(0.85、0.90、0.95)的稻谷和糙米接種黃曲霉菌孢子后在25℃和30℃培養(yǎng)箱中儲存10 d，每隔24 h取樣一次。

1.3.4 氣相色譜法測定呼吸作用

黃曲霉菌感染后的稻谷和糙米瞬時呼吸作用測定:將10.0 g感染黃曲霉菌的不同水分活度(0.85、0.90、0.95)稻谷和糙米預(yù)先在 4 mL Chromacol自動進(jìn)樣器樣品瓶中平衡。然后將這些樣品放在用甘油水溶液維持大氣相對濕度要求的相對平衡濕度的3 L氣室中待用。氣相色譜儀使用的是帶熱導(dǎo)檢測器的安捷倫6890N氣相色譜儀，載氣為氦氣。二氧化碳溶度百分比用于計算呼吸速率R(mg·kg－1·h－1)、CO2累積量和干物質(zhì)損失(DML)。色譜圖通過公式計算CO2體積:

式中:10.2代表用于日常校準(zhǔn)儀器標(biāo)準(zhǔn)樣品的CO2溶度，隨后計算呼吸速率R為:

式中:V代表取樣過程中增加空氣的頂部空間體積(共45 mL);d代表CO2的密度(1.977 mg/mL);m代表樣品干重(本實驗為0.01 kg);t代表檢測持續(xù)時間(1 h)。各個條件下干物質(zhì)損失百分比計算:

式中:T(h)代表實驗持續(xù)周期(本實驗為240 h)。

1.3.5 稻谷和糙米AFB1的提取和定量分析

將10.0 g黃曲霉菌感染后的稻谷和糙米樣品在60℃烘干48 h后用實驗室粉碎機(jī)粉碎后，其中5 g次級樣品利用AflaStarTMR免疫親和柱提取AFB1用于高效液相色譜熒光法的定量分析，AflaStarTMR免疫親和柱的具體使用方法參見廠家試劑盒說明書。提取純化的AFB1利用三氟乙酸進(jìn)行衍生化，然后用1 mL注射器將樣品通過0.22 mm濾膜過濾的樣品注入液相色譜樣品瓶中用高效液相色譜熒光法進(jìn)行定量分析，定量分析方法參照 1.3.2。

1.3.6 統(tǒng)計分析

利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩個處理數(shù)據(jù)采用t檢驗進(jìn)行比較，兩個以上處理數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(Two－way ANOVA)進(jìn)行比較，p－values＜0.05視為不同處理具有顯著性差異的判定標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中呼吸速率和CO2累積量的比較

通過瞬時呼吸速率計算稻谷和糙米在儲藏過程中發(fā)生霉變所產(chǎn)生的二氧化碳總量。圖1結(jié)果表明，發(fā)生霉變后隨著儲存時間的延長稻谷和糙米的呼吸速率和總CO2累積量不斷增加，其中0.95水分活度儲存稻谷和糙米的呼吸速率和總CO2累積量顯著高于0.85和0.90水分活度稻谷和糙米(P＜0.05)。而稻谷和糙米的比較發(fā)現(xiàn)，糙米的呼吸速率和總CO2累積量均較稻谷高，其中高水分活度糙米更顯著。說明在儲藏過程中隨著霉變的發(fā)生糙米的呼吸速率較稻谷快，其總呼吸量較稻谷多。且谷物水分活度越大，在儲存過程中其呼吸速率和總CO2累積量越大。

圖1 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中呼吸速率和CO2累積量變化

2.2 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失的比較

不同水分活度稻谷和糙米不同儲存溫度條件下霉變過程中干物質(zhì)損失的比較結(jié)果表明，接種黃曲霉菌后，儲存10 d的稻谷和糙米干物質(zhì)損失率隨著谷物水分活度和溫度的增加而增加。其中稻谷的干物質(zhì)損失較糙米少，高水分活度(0.95)稻谷的干物質(zhì)損失率約為4%而糙米約為15%～20%。有趣的是高水分活度(0.95)稻谷在25℃儲存條件下干物質(zhì)損失率較30℃儲存條件下干物質(zhì)損失率高，這與糙米結(jié)果有所差異(圖2a，圖2b)。

2.3 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中AFB1累積的比較

不同水分活度稻谷和糙米不同儲存溫度條件下霉變過程中AFB1累積的比較結(jié)果表明，接種AFB1后，儲存10 d的稻谷和糙米AFB1的含量隨著谷物水分活度和儲存溫度的增加而增加。所有接種過黃曲霉菌的樣本儲存10 d后檢測到的AFB1累積水平都高于我國國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的稻谷和糙米中AFB1限量水平(10μg/kg)，但糙米中黃曲霉毒素B1的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于稻谷中的含量，說明糙米在儲存過程中更易發(fā)生霉變。在同一谷物水分活度條件下，儲存溫度的升高會導(dǎo)致AFB1累積量的增加。所以高溫高水分活度儲存條件有利于黃曲霉菌的生長，導(dǎo)致AFB1污染加重，而糙米較之稻谷更易受黃曲霉菌的侵染，加重AFB1的污染(圖2c，圖2d)。

圖2 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失和AFB1累積的比較

干物質(zhì)損失是霉菌生長消耗造成的，而進(jìn)一步分析稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失和AFB1累積量的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，二者具有高度相關(guān)性，其中稻谷和糙米霉變過程中二者的相關(guān)系數(shù)分別為0.992和0.985 9(圖3)，干物質(zhì)損失由谷物的呼吸速率決定，所以通過谷物的呼吸速率預(yù)測谷物霉變過程中真菌毒素累積的風(fēng)險具有一定的可行性。

圖3 不同水分活度稻谷和糙米霉變過程中干物質(zhì)損失和AFB1累積量的相關(guān)性分析

3 討論

本研究儲存10 d的稻谷和糙米干物質(zhì)損失率隨著谷物水分活度和溫度的增加而增加的結(jié)果與研究人員在燕麥和玉米中發(fā)現(xiàn)干物質(zhì)損失受水分活度顯著影響的結(jié)果一致［15－16］。而稻谷干物質(zhì)損失較糙米低，可能是因為稻谷較糙米的呼吸速率低，另稻谷具有保護(hù)作用的稻殼，而糙米中的淀粉更容易被真菌所利用導(dǎo)致的［17］。同時，糙米營養(yǎng)物質(zhì)的高利用率導(dǎo)致了更快的真菌繁殖力，更高的谷物呼吸速率和更多的谷物干物質(zhì)損失，尤其是在高水分活度(0.95)處理條件下干物質(zhì)損失更多。有趣的是0.95水分活度稻谷的最大干物質(zhì)損失率出現(xiàn)在25℃條件下而不是30℃條件，這可能是由于25℃儲存條件下是稻谷中自然攜帶的真菌菌株的最佳生長環(huán)境溫度導(dǎo)致的。

接種黃曲霉菌孢子的高水分活度稻谷和糙米在儲存10 d后AFB1累積量最高。這一結(jié)果與AFB1在稻谷中最佳產(chǎn)毒環(huán)境范圍為溫度在25到30℃之間，水分活度接近0.99的研究結(jié)果相似［18］。小麥中的研究表明水分活度對AFB1累積量的影響較溫度高［19］。但也有些研究表明，溫度和水分活度的相互作用條件下由于傳毒媒介和菌株品系的不同，AFB1的累積量會不同。而糙米中的毒素累積量大于稻谷再次證明了稻殼對米粒的物理保護(hù)作用。對于高溫高濕儲存條件地區(qū)，糙米的品質(zhì)劣變和毒素污染風(fēng)險更大，這些地區(qū)應(yīng)采取稻谷儲存方式并注意儲存環(huán)境的濕度變化。

本研究結(jié)果還表明谷物的實時呼吸速率用于預(yù)測谷物霉變過程中真菌毒素累積的風(fēng)險具有一定的可行性。大米呼吸作用的實時監(jiān)測等產(chǎn)后管理措施應(yīng)該考慮被用作真菌活動的早期指標(biāo)，以防加工大米受真菌的侵染和毒素累積污染。劉焱等［20］通過對儲糧霉變產(chǎn)氣與毒素含量變化的相關(guān)性進(jìn)行分析，得出快速生長及產(chǎn)毒菌株的產(chǎn)氣會出現(xiàn)明顯的加速現(xiàn)象，且產(chǎn)氣速率變化時間比產(chǎn)毒時間提前一周左右。所以產(chǎn)氣的加速特點(diǎn)可以應(yīng)用于對實倉中霉變危害的預(yù)測，而對毒素的提前預(yù)測作用，則可以對儲糧中產(chǎn)生毒素的情況進(jìn)行提前預(yù)警，降低儲糧受毒素污染的風(fēng)險。耿旭等［21］也研究了不同生理狀態(tài)霉菌活動導(dǎo)致糧堆中CO2濃度變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)可以通過糧堆CO2濃度變化監(jiān)測結(jié)果了解儲糧中霉菌活動的生長狀態(tài)，從而甄別儲糧受霉菌危害的風(fēng)險程度。所以通過綜合谷物加工、真菌侵染、真菌毒素的產(chǎn)生、谷物呼吸速率變化和谷物干物質(zhì)損失臨界條件的研究用于預(yù)測谷物儲存品質(zhì)劣變的生物模型可以更好的進(jìn)行谷物產(chǎn)后儲存管理。