郭義敏 ，路健 ，陳艷 ，王歡 ，羅果 ，許運(yùn)斌

1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院小兒內(nèi)二科，貴州遵義 563000；2.遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州遵義 563000

手足口?。℉FMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童。近幾年來，我國發(fā)生了大規(guī)模的HFMD暴發(fā)疫情，尤其是在疫情中EV71和Cox A16感染引起的神經(jīng)性疾病的迅速增加，少數(shù)患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，病情發(fā)展迅速,最終導(dǎo)致死亡[1-2]其原因可能為嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，免疫力普遍低下有關(guān)[3-4]。且目前使用激素及免疫球蛋白能取得良好效果[5-6]，故推測重癥手足口病的發(fā)生與免疫功能紊亂有著密切的關(guān)系。但是具體機(jī)制尚不清楚。穿孔素基為常見的免疫異?；颍菣C(jī)體內(nèi)具有細(xì)胞毒作用的效應(yīng)分子，儲(chǔ)存在細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）和NK細(xì)胞胞質(zhì)顆粒中的糖蛋白，由于基因發(fā)生突變，不但T細(xì)胞及NK細(xì)胞數(shù)量及活性減低，其細(xì)胞功能也明顯下降，導(dǎo)致細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致器官功能異常，甚至死亡[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)在一些與免疫功能相關(guān)的疾病，如嗜血細(xì)胞綜合征、急性白血病等疾病中發(fā)現(xiàn)有穿孔素基因突變等，但是在重癥手足口病中有無異常尚未見報(bào)道，基于此，該研究方便選取2016年9月—2017年2月間80例手足口病患者與40名正常體檢者為研究對象，進(jìn)一步了解穿孔素基因與重癥手足口病的關(guān)系，為降低重癥手足口病的發(fā)病率，降低致殘率及死亡率等提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取在遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科住院資料完整并符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的患兒為實(shí)驗(yàn)組，按病情輕重分為普通病例組（n=40例）、重型病例組（n=40例），同時(shí)隨機(jī)抽取健康體檢兒童40名為正常對照組，手足口病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《手足口病診療指南(2010年版)》[1]。各組患兒年齡、性別、身高、體重等方面均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 臨床診斷病例 ①流行季節(jié)3～10月，常見于5歲以下兒童。②發(fā)熱并伴有四肢或臀部皮疹或口腔皰疹。③重癥病例臨床診斷需要結(jié)合神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，并需要腦脊液等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果支持。

1.2.2 重型病例組納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合手足口病臨床診斷，住院過程中出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累的患者；②實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果支持重癥診斷結(jié)果；③自愿接受入院后病例隨訪和檢測的患者。

1.2.3 普通病例組納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合手足口病臨床診斷，住院過程中未合并神經(jīng)系統(tǒng)受累癥狀的患者；②自愿接受入院后病例隨訪和檢測的患者。

納入病例均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①未完成隨訪、檢測者；②入院時(shí)合并肺出血、先天性心臟病、免疫缺陷者；③其他影響該研究的因素。

1.4 觀察指標(biāo)

①分析試驗(yàn)組與對照組的基因突變情況；②比較普通、重癥、危重癥組患兒的穿孔素，T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞數(shù)量、B淋巴細(xì)胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理和分析，計(jì)數(shù)資料和計(jì)量資料分別用所占比例和（±s）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常對照組比較，普通病例組出現(xiàn)c.900C＞T(p.His300=)，同義突變（純合突變）4例，重型病例組出現(xiàn)14例，正常對照組3例。具體分布見表1。

表1 試驗(yàn)組與對照組基因突變情況比較

3 討論

手足口病是由屬于小RNA病毒科的多種腸道病毒引起的傳染病，在皮膚科屬于常見疾病。手足口病的易感因素、發(fā)病機(jī)制認(rèn)為與免疫有關(guān),目前很多學(xué)者均認(rèn)為，重癥手足口病的發(fā)生及發(fā)展，細(xì)胞免疫功能在其中發(fā)揮極其重要的作用，導(dǎo)致細(xì)胞因子大量產(chǎn)生，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致器官功能異常，甚至死亡。王飛舟等[8]對7例重癥死亡患兒進(jìn)行尸檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾臟及淋巴結(jié)嚴(yán)重破壞，見壞死破碎的細(xì)胞碎片及單核細(xì)胞吞噬現(xiàn)象，推測其免疫功能下降也是導(dǎo)致患兒加重或死亡的主要原因。張艷芳等[9]強(qiáng)調(diào)免疫功能異常時(shí)導(dǎo)致重癥手足口病非常重要的原因。方代華等[10]認(rèn)為，免疫功能低下患兒感染EV71后更可能發(fā)展為重癥病例，同時(shí)強(qiáng)調(diào)一旦懷疑或診斷HFMD患兒，入院積極監(jiān)測免疫功能，若出現(xiàn)異常，盡早干預(yù)治療，適時(shí)應(yīng)用免疫球蛋白調(diào)節(jié)免疫功能及激素抗炎等對癥智聯(lián)，可控制病情及改善轉(zhuǎn)歸，減少死亡。王軍等[11]強(qiáng)調(diào)，NK細(xì)胞屬固有免疫，可分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，為抗病毒免疫的第一防線，提高NK細(xì)胞比例和增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，有利于疾病的早期痊愈或減少心肌并發(fā)癥的發(fā)生。穿孔素(perforin）屬于成孔蛋白（PFP)是一種分子量為67kD,存在于細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和NK細(xì)胞胞質(zhì)的細(xì)胞毒顆粒中的糖蛋白。穿孔素基因?yàn)槌Ｒ娒庖弋惓；?，是機(jī)體內(nèi)具有細(xì)胞毒作用的效應(yīng)分子，儲(chǔ)存在細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）和NK細(xì)胞胞質(zhì)顆粒中，兩種效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞接觸而激發(fā)顆粒胞吐，所釋放的穿孔素通過聚合作用而在靶細(xì)胞表面形成多聚穿孔素管狀通道，使顆粒酶進(jìn)入靶細(xì)胞，導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解破壞；穿孔素還可使一些顆粒分子如顆粒溶解素（granulysin）進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，對胞內(nèi)感染發(fā)揮免疫作用[12-14]。周曉姮等[15]初步探討了PRF1基因突變與患兒免疫細(xì)胞功能和臨床表現(xiàn)的關(guān)系，結(jié)果顯示8例噬血細(xì)胞性淋巴組織細(xì)胞增生癥患兒中有3例存在PRF1外顯子編碼區(qū)雜合錯(cuò)義突變，其中患兒及其父、兄或者母、弟的外周血CD8+T細(xì)胞穿孔素陽性率(0%～1.48%)和NK細(xì)胞穿孔素陽性率(8.69%～32.10%)與正常對照組相比有明顯減少。該次研究選取兒科住院資料完整并符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的患兒為試驗(yàn)組，按病情輕重分為普通病例組、重型病例組、同時(shí)隨機(jī)抽取健康體檢兒童為正常對照組，結(jié)果顯示，手足口病患兒中，c.900C＞T(p.His300=)，同義突變（純合突變），重型病例組14例，正常對照組3例，普通病例組出現(xiàn)4例，重型突變的比例顯著高于正常對照組和普通型患兒 （P＜0.05）。正常對照組NK細(xì)胞活性≤15%5例，普通病例組有13例，重型病例組有32例，其中重型出現(xiàn)比例顯著高于正常對照組與普通病例組（P＜0.05），由此可見隨著病情的加重，穿孔素基因突變增加，且NK細(xì)胞活性減低。由此可見，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能下降，均提示免疫功能的下降與穿孔素基因突變有關(guān)。

綜上所述,通過該研究觀察到重癥手足口病患兒的穿孔素基因c.900C>T(p.His300=)，同義突變（純合突變）的表達(dá)與病情嚴(yán)重程度成癥相關(guān)，NK細(xì)胞活性減低呈負(fù)相關(guān)，但具體的臨床意義還有待進(jìn)一步深入探討。