羅宇文 ，李瑤 ，景奉香

1.復旦大學生命科學學院，上海 200438；2蘇州溯源精微生物科技有限公司，江蘇蘇州 215300；3.中國科學院上海微系統(tǒng)與信息技術研究所，上海 200042

1999年B.Vogelstein[1]在檢測KRAS突變時提出了數(shù)字PCR概念。2011年數(shù)字PCR儀器問世，但是國內鮮有對數(shù)字PCR液態(tài)活檢靈敏度的量化評價研究[2-4]。

21世紀初，美國臨床和實驗室標準院發(fā)表了EP-17A文件—確定檢測下限（Limit of Detection，LOD）與定量下限（Limit of Quantification，LOQ）的方法。同時，國際標準化組織也頒布了論述LOD的文件—ISO 11 843。但業(yè)界缺乏對于LOD重要性的認知導致的，現(xiàn)有的標準也忽略了現(xiàn)代儀器的特點而且往往只適用于正態(tài)分布[5]。該研究于2017年1月基于Bio-Rad公司的QX200微滴式數(shù)字 PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）系統(tǒng)量化評價了數(shù)字PCR對cfDNA中腸癌相關KRAS突變檢測的靈敏度，并比較了計算方式間差異。為數(shù)字PCR標準化提供了方法依據(jù)，為數(shù)字PCR應用于腫瘤液態(tài)活檢提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標準品

質粒標準品由實驗室構建并克隆，選擇KRAS基因12和13號外顯子上7個突變型和野生型基因作為備選基因， 突變型包括：G12C、G12V、G12D、G12R、G12S、G12A、G13D。

1.2 樣品處理

20名平均年齡45歲健康人對照血漿標本均來自于鄭州大學附屬醫(yī)院。血漿按照臨床常規(guī)方法采集血液，在采集分離當天提取cfDNA。

1.3 微滴式數(shù)字PCR方法建立

ddPCR引物探針設計原理為TAQ-MAN探針法。擴增子為7種常見KRAS突變基因型與野生型KRAS，所有突變型和野生型使用通用上下游引物并分別針對每種突變型設計FAM標記的Taqman探針，同時對于KRAS野生型設計HEX標記的Taqman探針，以FAM與HEX的拷貝數(shù)讀值比例體現(xiàn)突變基因含量。每個反應體系中加入2 μL反應模板。

將每個配制好的PCR反應體系通過QX200?Droplet Generator(Bio-Rad)制備為20 000個反應微滴并于普通PCR儀上進行擴增。PCR反應結束后將96孔板放入QX200TMDroplet Reader(Bio-Rad)中同時檢測FAM和HEX的熒光信號。儀器會自動分析每個樣品的每個微滴中熒光信號，獲得靶序列在PCR反應體系中的拷貝數(shù)濃度(單位：copies/μL)及突變濃度。

1.4 方法學論證

1.4.1 檢測性能分析 通過梯度混合不同比例的突變型質粒標準品分別使用ddPCR進行3重復檢測，并同時檢測野生型質粒標準品與空白對照，所有標準品質粒在反應體系中的終濃度為1×105拷貝。以野生型質粒及空白對照檢測結果的假陽性程度判定檢測方法的特異性，以梯度混合突變型質粒的穩(wěn)定檢出范圍（變異系數(shù)CV≤25%、決定系數(shù)R2≥0.98）定義LOQ。

G12C和G12D基因型梯度混合突變型質粒的梯度依次為：100%、10%、1%、0.1%、0.01%； G12V、G12R、G12S、G12A、G13D基因型梯度混合突變型質粒的梯度依次為：1%、0.2%、0.1%、0.04%、0.01%。

1.4.2 LOD計算 如果以ISO 11843及EP-17A的分析方式來討論ddPCR的LOD，則默認其檢測結果服從正態(tài)分布，由于在抽樣量足夠大的情況下，泊松分布的極限是正態(tài)分布，所以該研究中嘗試了正態(tài)分布相關的LOD算法：

其中μb為陰性對照測得均值，σb為陰性對照測得標準差，σs為低濃度陽性樣本測得標準差，LOB為空白本底檢測限（Limit of Blank）。

對于ddPCR更為科學的方式是通過泊松分布的置信區(qū)間計算LOD。首先LOB需要通過假陽性率（False Positive Rate，F(xiàn)PR）計算，這里的FPR定義為平均每個反應中出現(xiàn)的假陽性微滴數(shù)，計算公式為：

以FPR的泊松分布正向95%置信區(qū)間分位數(shù)作為LOB，同時以LOB作為LOD的負方向95%置信區(qū)間分位數(shù)來推測LOD的數(shù)學期望。其估計方法最常見為查閱泊松分布概率密度函數(shù)表，在Milbury等的研究中則采用了泊松分布樣本量較大時的正態(tài)分布近似計算法[6]如表1所示。

表1 泊松分布的正態(tài)近似LOD計算方法

2 結果

2.1 ddPCR檢測線性

圖1所示為G12C與G12D的理論/測得值線性圖，圖 2 所示為 G12V、G12R、G12S、G12A、G13D 的理論/測得值線性圖。所有突變型各樣品都檢出陽性，0.1%及以上濃度的CV都小于25%。野生型質粒和空白對照檢測結果都沒有出現(xiàn)假陽性，所有突變基因型線性方程的R2都大于0.98。

圖1 G12C與G12D線性圖，橫軸為理論值，縱軸為測得值

圖2 G12V、G12R、G12S、G12A、G13D 的線性圖，橫軸為理論值，縱軸為測得值

2.2 健康人樣本的ddPCR檢測及LOD值

該研究中比較了3種ddPCR理論LOD值判定法：第1種是依據(jù)正態(tài)分布計算LOD(LOD判定法1)，其低濃度樣本誤差來自0.01%及0.04%質粒標準品的ddPCR檢測數(shù)據(jù)。第2及第3種都依據(jù)于ddPCR中陽性微滴符合泊松分布，區(qū)別是LOD判定法2采用表1中的計算法，而判定法3采用了查表法。具體判定結果見表2。

表2 3種不同方法判定的ddPCR KRAS突變檢測法的LOD

3 討論

在腫瘤突變基因的液態(tài)活檢中，cfDNA由于含量極低所以對于檢測方法的靈敏度及低濃度下定量精確度有較高要求。數(shù)字PCR應用于腫瘤突變基因液態(tài)活檢國外已有報道，其定量檢測數(shù)據(jù)優(yōu)于qPCR[7-8]。但同類研究大多都還在使用標準品實驗經驗值判定靈敏度而沒有使用量化的臨床判定標準，所以該研究基于泊松分布的數(shù)學模型進行LOD、LOQ分析的意義重大。

ddPCR的LOD對應反應中拷貝數(shù)總量為3.48拷貝，由于目前所使用ddPCR設備的總微滴數(shù)上限為20 000個，對應可測得拷貝數(shù)上限為100 000拷貝，精確定量可達到20 000拷貝，故其靈敏度可以達到0.017%～0.003%。而同類qPCR或ARMS-PCR的靈敏度則一般為0.1%左右。

以該次實驗結果可判斷，微滴式數(shù)字PCR具有超過現(xiàn)有常見PCR方法的靈敏度和定量精準度，其LOD可以以泊松分布量化計算。同時，該研究中LOD判定法3在臨床血漿cfDNA液態(tài)活檢應用中，數(shù)字PCR測得值可以與中國人理論突變水平對應，驗證了其可靠性。綜上所述，數(shù)字PCR適合用與液態(tài)活檢等高靈敏度需求的應用。

綜上所述，該研究量化評估了數(shù)字PCR在對于血漿cfDNA中KRAS突變檢測實驗中的靈敏度，研究中確立的LOD算法有足夠的統(tǒng)計學依據(jù)與實驗證據(jù)支持，可以推廣到多種基于數(shù)字PCR檢測實驗的靈敏度判定中。同時，該研究中基于臨床樣本判定的LOD可以使用大量臨床樣本進行驗證，并結合患者確診情況和用藥情況建立ROC曲線、確定科學的Cut Off值，為臨床應用奠定基礎。