張喬，姜蘇洋，呂航，王博涵

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150076；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

中醫(yī)學(xué)關(guān)于“正氣存內(nèi)、邪不可干，邪之所湊、其氣必虛”的經(jīng)典論述中，“正氣”作為防御外邪入侵的高度功能概括，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫功能不謀而合。黨參在《本草正義》中有“補脾養(yǎng)胃，潤肺生津，健運中氣，本與人參不甚相遠(yuǎn)[1]。”茯苓始載于《本草經(jīng)》，具有健脾補中、養(yǎng)心安神、利水滲濕之效[2]。黨參配茯苓，可補氣健脾，兼能除濕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，以上兩味中藥所含多種成分對機體免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均具有顯著作用。本實驗旨在通過上述兩味中藥對環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能的影響[3]，來確立最顯著藥效的劑量應(yīng)用，以期能夠為提高機體免疫系統(tǒng)功能提供可參考的量化數(shù)據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

昆明KM小鼠SPF級，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g。普通級豚鼠，雄性，250～300 g，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。雌雄分開喂養(yǎng)，室溫(20±2)℃，濕度50%～70%，采用晝夜間斷照明，動物自由進(jìn)食、飲水，適應(yīng)環(huán)境2周。

1.2 實驗試劑

環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32020857)；中華墨汁(哈爾濱泰信墨業(yè)有限公司)；綿羊紅細(xì)胞(北京博爾西科科技股份有限公司，批號161112)；二硝基氟苯(廣東惠令化學(xué)試劑有限公司，批號160935)；黨參、茯苓(哈爾濱世一堂制藥廠飲片)。

1.3 實驗儀器

WZ-2A微量振蕩器(北京海淀電子醫(yī)療儀器廠)；TG16A-WS型臺式高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；UV-9100紫外可見分光光度計(北京瑞利分析儀器廠)；微量加樣器(德國Eppendor)。

2 方法

2.1 實驗方法

將40只小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組(A)、模型對照組(B)、高劑量實驗組(C)、低劑量實驗組(D)。均灌胃生理鹽水0.2 ml/10 g，連續(xù)3天。第4天，A組皮下注射生理鹽水60 mg/kg，B、C、D組皮下注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg。然后A、B組灌胃給藥生理鹽水0.2 ml/10 g，連續(xù)3天，C組灌胃給藥水煎液0.2 ml/10 g，連續(xù)3天，D組灌胃給藥水煎液0.1 ml/10 g，連續(xù)3天。

2.2 對免疫器官重量的影響

40只小鼠按上述A、B、C、D組末次給藥后1 h，脫頸椎處死，取胸腺和脾臟精密稱取濕重。

按照如下公式計算臟器系數(shù)：

臟器系數(shù)=臟器重量(mg)/體質(zhì)量(g)

2.3 對單核巨噬細(xì)胞的影響

另取40只小鼠按上述A、B、C、D組方法造模,末次給藥后1 h，從小鼠的尾靜脈注射已稀釋的中華墨汁0.05 ml/10 g，注射墨汁后2 min和10 min，分別對小鼠的內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并且立即將其加到2 ml的0.1% Na2CO3溶液中。以0.1% Na2CO3溶液作為空白對照，用分光光度計在600 nm波長處測定血液樣本光密度OD值。然后斷頸處死小鼠，取肝臟和脾臟，分別稱重[4]。

按照以下公式計算碳廓清指數(shù)K，吞噬指數(shù)α。

K=(lgC1-lgC2)/(t2-t1)

α=W/WLS×K1/3

K為未經(jīng)校正的吞噬指數(shù)

W為體質(zhì)量

WLS為肝脾合重

C1為t1(2 min)時血樣本的光密度值

C2為t2(10 min)時血樣本的光密度值

2.4 對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

另取40只小鼠按上述A、B、C、D組灌胃給藥,第3天，每組10只小鼠，用硫化鋇均勻涂抹腹部皮膚進(jìn)行脫毛，然后用 DNFB溶液50 μL涂抹致敏。灌胃給藥第8天，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于每一組小鼠右耳雙面進(jìn)行致敏攻擊。攻擊后24 h脫頸處死小鼠，剪下左右耳。用打孔器取下直徑 8 mm的耳片，進(jìn)行稱重。用左右耳重量之差反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的強弱程度。

2.5 對體液免疫功能的影響

取豚鼠7只進(jìn)行補體制備，在飼喂前每只心頭取血10 ml左右于EP管中，在37℃恒溫箱中靜置30 min，后置在4℃冰箱內(nèi)，待血清析出，上離心機，3 000 rpm離心15 min，取上清液。

另取40只小鼠按上述A、B、C、D組灌藥第3天，每組取10只小鼠，腹腔注射10%的SRBC致敏，0.2 mL/只，每天給藥1次，連續(xù)給藥4天。致敏后第5天，眼眶內(nèi)眥靜脈叢采血制備血清。將血清樣本用生理鹽水500倍稀釋后，各組樣品管中分別加入1∶500試驗小鼠血清稀釋液1 ml；10% SRBC 0.5 ml、以及1∶10補體血清稀釋液1 ml震蕩混勻，再另取空白管，分別加入等量的補體、SRBC及1 ml生理鹽水。然后將各管置于37℃水浴中孵育10 min，冰浴10 min后終止，2 000 rpm離心10 min，取上清液，在可見光分光光度計540 nm處測定各管OD值，記錄結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方水煎劑對免疫器官重量的影響

表1結(jié)果顯示，模型對照組與正常對照組相比，模型對照組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.01)。低劑量實驗組與模型對照組相比，低劑量實驗組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)在原始數(shù)據(jù)值上觀察有相應(yīng)的提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。高劑量實驗組與模型對照組相比，高劑量實驗組小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)顯著升高(P<0.01，P<0.05)。

表1 復(fù)方水煎劑對免疫器官重量的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 復(fù)方水煎劑對單核巨噬細(xì)胞的影響

表2結(jié)果顯示，模型對照組與正常對照組相比，模型對照組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α顯著降低(P<0.01)。低劑量實驗組與模型對照組相比，低劑量實驗組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α在原始數(shù)據(jù)值上觀察有相應(yīng)的提高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。劑量實驗組與模型對照組相比，高劑量實驗組小鼠的吞噬指數(shù)K與吞噬系數(shù)α顯著升高(P<0.01)。

表2 復(fù)方水煎劑對單核巨噬細(xì)胞的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.3 復(fù)方水煎劑對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

由表3結(jié)果顯示，模型對照組與正常對照組相比，模型對照組小鼠的耳腫脹程度顯著降低(P<0.01)。低劑量實驗組與模型對照組相比，低劑量實驗組小鼠的耳腫脹程度無明顯差異(P>0.05)。高低劑量實驗組與模型對照組相比，高劑量實驗組小鼠的耳腫脹程度顯著升高(P<0.01)。

表3 復(fù)方水煎劑對遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.4 復(fù)方水煎劑對體液免疫功能的影響

由表4結(jié)果顯示，模型對照組與正常對照組相比，模型對照組小鼠的型對照組小鼠血清中溶血素抗體的含量顯著降低降低(P<0.01)。低劑量實驗組與模型對照組相比，低劑量實驗組小鼠血液中溶血素抗體含量無明顯差異(P>0.05)。高低劑量實驗組與模型對照組相比，高劑量實驗組小鼠血清中溶血素抗體含量顯著升高(P<0.01)。

表4 復(fù)方水煎劑對體液免疫功能的影響

注：與正常組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

環(huán)磷酰胺(CY)是臨床中常用一種免疫抑制劑，可殺死免疫細(xì)胞，影響巨噬細(xì)胞，同時抑制體液和細(xì)胞免疫系統(tǒng)[4-5]。因此CY誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠被用來研究藥物的免疫調(diào)節(jié)活性視為經(jīng)典方法[6]。本研究結(jié)果顯示，CY對照組小鼠的各項免疫檢測指標(biāo)均低于高、低劑量組(P<0.05)，表明成功建立免疫抑制動物模型。

免疫器官根據(jù)發(fā)生的時間順序與功能差異分為中樞免疫器官與外周免疫器官兩部分。本實驗選擇中樞免疫器官中的胸腺與外周免疫器官中的脾臟[7]。因胸腺可訓(xùn)化T細(xì)胞，脾臟是體內(nèi)形體最大的淋巴器官，富含T細(xì)胞，且是發(fā)生免疫應(yīng)答的靶向作用點。本實驗通過參苓水煎液對免疫抑制模型小鼠免疫器官指數(shù)的影響，表明參苓水煎液高低劑量均可使已經(jīng)處于萎縮狀態(tài)的免疫器官恢復(fù)，并呈現(xiàn)劑量遞增趨勢。

吞噬作用一般用于評估動物的非特異性免疫狀態(tài)[8]。巨噬細(xì)胞[9]的吞噬作用是最重要的，可防御所有類型的入侵細(xì)胞，還可通過分泌細(xì)胞因子和處理呈現(xiàn)抗原，間接發(fā)揮作用從而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。本實驗研究表明，高、低劑量組參苓水煎液能增強腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬作用，并且高劑量組優(yōu)于低劑量組。

遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)又稱為IV型超敏反應(yīng)，是由單個核細(xì)胞浸潤與組織細(xì)胞損傷為主要特征的反應(yīng)機體細(xì)胞免疫功能的細(xì)胞免疫反應(yīng)。本實驗利用二硝基氟苯(dinitrofluorobenzene,DNFB)為致敏原，先于小鼠腹部涂抹致敏，生成致敏淋巴細(xì)胞。再于致敏后第6天小鼠耳朵涂抹再次攻擊致敏，并于攻擊高峰段致敏后24 h進(jìn)行驗證試驗。由本實驗結(jié)果可知環(huán)磷酰胺可抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)的進(jìn)行，高低劑量參苓水煎液均可拮抗環(huán)磷酰胺此功能，進(jìn)而增加遲發(fā)型超敏反應(yīng)的強度。

體液免疫為機體特異性免疫，抗體形成細(xì)胞數(shù)量的多少可反映體液免疫功能的強弱。以往研究中IgM為體液免疫作用機制中對抗原最具親和力的抗體[10]，本實驗即通過測定溶血素的OD值反映IgM的含量。實驗結(jié)果顯示,高劑量組免疫抑制小鼠的溶血素含量有顯著提升，因此提示參苓水煎液可提高免疫抑制模型小鼠的體液免疫功能。

黨參有補中益氣之效，茯苓具健脾滲濕之功，二者合用，共奏補中健脾之性。脾主運化，為運行中氣，滋養(yǎng)四肢百骸之臟。而健運脾陽、補中益氣，可提升人體正氣和中氣，這與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中提高機體免疫力具有相通的作用和性質(zhì)。本實驗將二者有機組合，進(jìn)行了不同劑量下配伍的免疫系統(tǒng)藥理學(xué)實驗研究，結(jié)果顯示在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下的中藥藥效配伍可為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的免疫系統(tǒng)研究提供樣本。