陳曉彤 黃立萍 孫 謐 郝建華

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響應(yīng)面分析法優(yōu)化α-環(huán)糊精的酶轉(zhuǎn)化工藝*

陳曉彤1,2黃立萍1,2孫 謐1郝建華1①

(1. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；2. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306)

為獲得較高的α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化產(chǎn)率，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方法，篩選底物種類、底物濃度、加酶量、酶作用時(shí)間、作用溫度和pH等多個(gè)單因素，對(duì)海洋芽孢桿菌Y112產(chǎn)的α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)α-環(huán)糊精的條件進(jìn)行了優(yōu)化。然后利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選得到影響α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的3個(gè)主要因素：底物濃度、溫度和pH值。最終采用響應(yīng)面分析法得到的最佳轉(zhuǎn)化條件為馬鈴薯淀粉濃度為5%，加酶量200 U/g(淀粉)，pH值為8.4，溫度30℃，200 r/min反應(yīng)6 h，α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率均值為28.67%，比優(yōu)化前的產(chǎn)率提高了2.48倍。

α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶；響應(yīng)面分析法；α-環(huán)糊精；轉(zhuǎn)化工藝

環(huán)糊精(CD)是由環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)作用于直鏈淀粉而產(chǎn)生的環(huán)狀低聚糖(Valle, 2004)，常見(jiàn)的有α-、β-和γ-環(huán)糊精。環(huán)糊精可以包埋形狀各異和適當(dāng)大小的疏水性客體分子，進(jìn)而改變它們的理化性質(zhì)(Biwer, 2002)。環(huán)糊精的化學(xué)性質(zhì)均較穩(wěn)定，α-環(huán)糊精在體內(nèi)的代謝作用最慢且無(wú)毒(Arima, 2011)。環(huán)糊精在醫(yī)藥(朱征等, 2016)，化妝品(李姝靜等, 2016)、環(huán)保領(lǐng)域(張洪偉, 2014)等有良好的應(yīng)用前景，而且作為一種新型的膳食纖維逐漸走入人們的視野(Artiss, 2006)。

大多數(shù)CGTase生成的是多種環(huán)糊精的混合體。Bharat等(2001)利用來(lái)自肺炎克雷伯菌AS-22分泌的CGTase酶生產(chǎn)α-環(huán)糊精。Duan等(2013)以α-CGTase和異淀粉酶作用于馬鈴薯淀粉，CD的總產(chǎn)量達(dá)到84.6%，比單獨(dú)使用α-CGTase的轉(zhuǎn)化率提高了31.2%。目前，環(huán)糊精的應(yīng)用依然受到環(huán)糊精產(chǎn)量的制約，繼續(xù)研究提高環(huán)糊精產(chǎn)率的方法具有重要意義。

本研究對(duì)前期篩選到的來(lái)自黃海海域的海洋芽孢桿菌Y112的α-CGTase生產(chǎn)α-環(huán)糊精的條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高α-環(huán)糊精的產(chǎn)量，以便應(yīng)用于食品藥品等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 酶的來(lái)源

α-CGTase酶：由菌株海洋芽孢桿菌Y112(與DSM8721的同源性為100%，本實(shí)驗(yàn)室分離自中國(guó)黃海水域)發(fā)酵提取制備獲得。

1.2 主要試劑

α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品(Aladdin, HPLC級(jí))；可溶性淀粉，玉米淀粉，馬鈴薯淀粉，麥芽糊精(索萊寶)；水溶性淀粉-底物(Aladdin, 藥用級(jí))；甲基橙(Aladdin, AR)；其他化學(xué)試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 α-CGTase酶活力的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組：取4 g水溶性淀粉，用配制好的pH=8.5的0.2 mol/L的NaOH-甘氨酸緩沖液100 ml (現(xiàn)用現(xiàn)配)溶解并進(jìn)行加熱糊化作為底物，待其冷卻后取0.9 ml液體在試管中，放入50℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后加入適當(dāng)稀釋倍數(shù)的粗酶液0.1 ml混合均勻， 50℃水浴反應(yīng)4 min，取出后迅速加入1 ml鹽酸溶液(1 mol/L)終止反應(yīng)，最后加入4 ml稀釋4倍的甲基橙溶液，混勻，室溫靜置20 min。

對(duì)照組：取底物0.9 ml于試管中，預(yù)熱5 min。隨實(shí)驗(yàn)組放入水浴反應(yīng)4 min后，加入1 ml鹽酸溶液混合均勻后，再加入與實(shí)驗(yàn)組相同的粗酶液，其他處理與實(shí)驗(yàn)組相同。用分光光度計(jì)在507 nm測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的吸光度。1個(gè)單位酶活定義為上述條件下生成1 μg α-環(huán)糊精需要的酶量(張曉磊等, 2015)。

1.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取一支試管，分別加入1 ml梯度濃度的α-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 ml 1 mol/L的鹽酸，再加入4 ml稀釋4倍的甲基橙溶液于試管中，搖勻，室溫靜置20 min，在507 nm處測(cè)吸光度。其中，空白不含α-環(huán)糊精，其余操作相同。以環(huán)糊精濃度為橫坐標(biāo)，吸光度差值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度差值(DOD)=空白溶液吸光度-樣品吸光度。

1.5 α-環(huán)糊精含量測(cè)定

將待測(cè)溶液按照1.4的步驟進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到α-環(huán)糊精的濃度，然后得出α-環(huán)糊精的含量值。

1.6 單因素法優(yōu)化α-CGTase作用淀粉產(chǎn)α-環(huán)糊精條件

1.6.1 底物種類對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 取5%濃度的玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、麥芽糊精和可溶性淀粉溶液各100 ml加熱溶解，待冷卻后，溫度30℃，pH為9，加酶量200 U/g淀粉，200 r/min，6 h取出煮沸滅活測(cè)α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.6.2 底物濃度對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 分別取3%、5%、8%、10%、15%、20%濃度的馬鈴薯淀粉溶液各100 ml加熱溶解，待冷卻后，溫度30℃，pH為9，加酶量200 U/g淀粉，200 r/min，6 h取出煮沸滅活測(cè)α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.6.3 酶添加量對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 5%濃度的馬鈴薯淀粉溶液100 ml，溫度為30℃，pH為9，分別加入100、150、200、250、300 U/g馬鈴薯淀粉的α-CGTase進(jìn)行反應(yīng)，200 r/min搖床反應(yīng)6 h后滅活測(cè)α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.6.4 溫度對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 5%濃度的馬鈴薯淀粉溶液100 ml，pH為9，加酶量200 U/g馬鈴薯淀粉，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃反應(yīng)，200 r/min搖床反應(yīng)6 h后煮沸滅活測(cè)定α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.6.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 5%濃度的馬鈴薯淀粉溶液100 ml加熱溶解，待冷卻后，溫度為30℃，pH為9，加酶量為200 U/g馬鈴薯淀粉，200 r/min，反應(yīng)分別進(jìn)行1、2、4、6、8、10、12、24 h后煮沸滅活測(cè)定α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.6.6 pH對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 5%濃度的馬鈴薯淀粉溶液100 ml，溫度30℃，加酶量200 U/g馬鈴薯淀粉，分別在pH為6、7、8、9、10條件下反應(yīng)，200 r/min搖床反應(yīng)6 h后煮沸滅活，測(cè)定α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.6.7 Mg2+濃度對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響 5%濃度的馬鈴薯淀粉溶液100 ml，pH值為9，溫度為30℃，加酶量為200 U/g馬鈴薯淀粉，分別加入終濃度為0~60 mmol/L的鎂離子，200 r/min搖床反應(yīng)6 h后滅酶測(cè)定α-CD產(chǎn)量。每個(gè)梯度做3次，取平均值。

1.7 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)α-環(huán)糊精條件

1.7.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取底物濃度、加酶量、溫度、時(shí)間和pH共5個(gè)因素，通過(guò)PB實(shí)驗(yàn)為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)篩選出酶催化淀粉生成α-環(huán)糊精的主要影響因子。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Tab.1 Experiment design of Plackett-Burman

1.7.2 中心組合確定最佳條件 根據(jù)PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert 8.06軟件設(shè)計(jì)BBD實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行分析(表2)(董延娟等, 2016)。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

Tab.2 Experiment design of Box-Behnken

2 結(jié)果與分析

2.1 α-環(huán)糊精的標(biāo)準(zhǔn)曲線

α-環(huán)糊精的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1，方程為=0.0373(2=0.9994)。

圖1 α-環(huán)糊精的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.2.1 底物種類對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 底物種類對(duì)α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響如圖2所示。由圖2可以看出，可溶性淀粉的環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率最高，麥芽糊精的轉(zhuǎn)化率最低。馬鈴薯淀粉的轉(zhuǎn)化率略低于可溶性淀粉。

圖2 不同底物對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響

環(huán)糊精可以由環(huán)糊精酶作用于不同種類的淀粉、糊精、直鏈淀粉和支鏈淀粉產(chǎn)生，得到高轉(zhuǎn)化率環(huán)糊精的底物是淀粉。而淀粉是由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，由于直鏈淀粉與脂質(zhì)容易形成復(fù)合物，不易酶活性的作用；支鏈淀粉有更多的還原端，與直鏈淀粉相比再生緩慢，以支鏈淀粉為底物的環(huán)糊精產(chǎn)量高于直鏈淀粉(Pishtiyski, 2006)。馬鈴薯淀粉的價(jià)格比較低，使得生產(chǎn)環(huán)糊精的成本降低，因此，本研究中馬鈴薯淀粉是適合生產(chǎn)環(huán)糊精的底物。

2.2.2 底物濃度對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 底物濃度對(duì)環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的影響如圖3所示。由圖3可以看出，當(dāng)?shù)矸蹪舛葹?%時(shí)，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率為25.9%，當(dāng)?shù)矸蹪舛壬?0%時(shí)，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率和5%時(shí)相比下降50%，二者相差較大，繼續(xù)增大底物濃度，轉(zhuǎn)化率降低越明顯?？赡苁且?yàn)轳R鈴薯淀粉濃度過(guò)大，加熱糊化后粘性過(guò)大，不利于酶與底物的反應(yīng)過(guò)程。相反，底物濃度越小，環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率越高，但成本升高，總的產(chǎn)量過(guò)低，綜合考慮，選用5%的馬鈴薯淀粉作為生產(chǎn)α-環(huán)糊精的淀粉濃度。

圖3 底物濃度對(duì)α-CD產(chǎn)量的影響

2.2.3 加酶量對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 圖4顯示，在一定范圍內(nèi)，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)加酶量為200 U/g時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。

環(huán)化反應(yīng)的逆反應(yīng)是耦合反應(yīng)，加酶量的增加，使酶的歧化、耦合反應(yīng)能力均增強(qiáng)，增加了體系中小分子糖的存在，促進(jìn)耦合反應(yīng)的進(jìn)行，使得α-環(huán)糊精向β-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化，不利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)?？刂泼傅奶砑恿靠梢杂行岣擀?環(huán)糊精的產(chǎn)量，減少酶的用量也可以降低成本。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，選擇200 U/g的加酶量。

圖4 酶添加量對(duì)α-CD生產(chǎn)的影響

2.2.4 溫度對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 從圖5可以看出，不同的溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響比較明顯，轉(zhuǎn)化率在30℃時(shí)最高，之后隨著溫度的繼續(xù)升高，α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率降低幅度增大。該酶的最適反應(yīng)溫度是 55℃，在40℃以下穩(wěn)定，高于50℃對(duì)酶活影響較大，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本保持一致，在不失活的狀態(tài)下， 30℃時(shí)最有利于α-環(huán)糊精的生產(chǎn)。

圖5 溫度對(duì)α-CD生產(chǎn)的影響

2.2.5 作用時(shí)間對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 由圖6可知，α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高點(diǎn)的時(shí)間為6 h，繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間，轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有增高，反而有明顯的降低趨勢(shì)。隨著反應(yīng)時(shí)間的加長(zhǎng)，酶的其他作用增強(qiáng)，造成α-環(huán)糊精的分解。另一方面，反應(yīng)時(shí)間的減少，更有利于節(jié)約成本。

2.2.6 pH對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 通過(guò)考察不同pH下α-環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示(圖7)，初始pH為9時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，此時(shí)即為α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化的最適反應(yīng)pH。不同的CGT酶反應(yīng)的體系的pH值是不同的，大多數(shù)是弱堿性或中性介質(zhì)(Jung, 2007)。有研究表明，底物種類–緩沖液類型對(duì)環(huán)糊精有重要的作用(Mau, 2007)，在此未對(duì)緩沖液的類型是否對(duì)轉(zhuǎn)化率有一定的影響做進(jìn)一步的探討。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)α-CD生產(chǎn)的影響

圖7 pH值對(duì)α-CD生產(chǎn)的影響

2.2.7 Mg2+濃度對(duì)α-環(huán)糊精生產(chǎn)的影響 之前的實(shí)驗(yàn)中，Mg2+對(duì)酶活性有一定的促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)考察反應(yīng)過(guò)程中添加量對(duì)反應(yīng)的影響。由圖8可知，由于生產(chǎn)α-環(huán)糊精的時(shí)間比較短，在一定范圍內(nèi)Mg2+濃度的增減對(duì)環(huán)糊精的轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有很大的影響，因此，后期實(shí)驗(yàn)中不考率金屬離子的添加量。

圖8 Mg2+濃度對(duì)α-CD生產(chǎn)的影響

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.3.1 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，得到PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分析如表4，底物濃度、溫度和pH的值小于0.055為顯著，因此，確定三者為酶轉(zhuǎn)化淀粉生產(chǎn)α-環(huán)糊精的主要影響因子。

2.3.2 中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 利用Design- Expert 8.06軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合(表6)，發(fā)現(xiàn)該模型是顯著的，值為506.71表示僅有0.01%的可能是由噪音引起的，其中A、B、C、AC、A2、B2、C2的值均小于0.05，是顯著模型項(xiàng)，失擬值為0.96(=0.4921)表示該模型的失擬不顯著，因此該模型是合適的。方程的2=0.9985，說(shuō)明α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的擬合度較好，該模型能較好解釋環(huán)糊精產(chǎn)率的變化。值越大，表明影響因子對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響越大。由方差分析表可得出，F(xiàn)A=369.36，F(xiàn)C=303.67，F(xiàn)B=33.64，即各因素對(duì)產(chǎn)物制備的影響程度大小順序?yàn)榈孜餄舛?pH>溫度。

表3 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Tab.3 Design and results in PB

表4 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

Tab.4 The analysis of the results of PB

“*”表示差異顯著(<0.05) * means significant difference (<0.05)

二次多項(xiàng)式回歸方程為：

=+28.58–0.91+0.28–0.83+0.012+0.57– 0.13–1.302–2.302–2.762

根據(jù)回歸方程，做響應(yīng)面圖(圖9)。

軟件分析得到最大響應(yīng)值(產(chǎn)量)時(shí)A、B、C對(duì)應(yīng)的最佳實(shí)驗(yàn)條件為：底物濃度4.61、溫度30.2℃、pH=8.4、反應(yīng)時(shí)間6 h，α-環(huán)糊精最大預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)化率為28.84%。按照實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳條件，為方便實(shí)驗(yàn)操作，在底物濃度5%、溫度30℃、pH=8.4、加酶量200 U/g、反應(yīng)6 h條件下進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)際轉(zhuǎn)化率為28.67%，與理論值接近。

3 討論

郭永華等(2016)通過(guò)定點(diǎn)飽和突變技術(shù)得到CGTase突變體N623T，在酶的最適溫度60℃和pH為6.5條件下反應(yīng)24 h，淀粉總轉(zhuǎn)化率從11.3%提高至39.7%，其中，α-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精所占比例分別為32.8%和7.7%，α-環(huán)糊精的總轉(zhuǎn)化率為13.02%。王琰等(2017)利用重組的α-CGTase酶轉(zhuǎn)化5%的馬鈴薯淀粉，58℃反應(yīng)15 h后，環(huán)糊精的總轉(zhuǎn)化率可達(dá)40.7%，轉(zhuǎn)化生成α-CD、β-CD和γ-CD比例分別為43.6%、41.8%和14.6%，即α-CD的轉(zhuǎn)化率為17.75%。與已報(bào)道的產(chǎn)環(huán)糊精最高的酶相比(Duan, 2013)，菌株Y112產(chǎn)的CGTase酶在堿性環(huán)境中更加穩(wěn)定，反應(yīng)時(shí)間僅為6 h，大大降低了生產(chǎn)成本，且在不添加有機(jī)試劑的條件下，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到28.67%，減小了環(huán)糊精的毒性，使得環(huán)糊精應(yīng)用范圍更廣，特別是醫(yī)藥，食品，化妝等方面，具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Tab.5 Design of Box-Behnken and results

4 結(jié)論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)分析了α-CGTase催化淀粉制備α-環(huán)糊精的條件，初步篩選得到的條件為：以馬鈴薯淀粉溶液為底物，5%的濃度，加酶量200 U/g (淀粉)，溫度30℃，pH為9，反應(yīng)時(shí)間6 h；利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響α-環(huán)糊精轉(zhuǎn)化率的5個(gè)因素進(jìn)行篩選，通過(guò)分析得知主要影響因素為底物濃度、溫度和pH值。采用響應(yīng)面分析法對(duì)α-CGTase轉(zhuǎn)化淀粉制備α-環(huán)糊精條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳轉(zhuǎn)化條件為底物濃度5%、pH 8.4、溫度30℃、200 r/min、反應(yīng)6 h。在最佳條件下制備α-CD轉(zhuǎn)化率均值為28.67%，比優(yōu)化前的產(chǎn)率提高了2.48倍。

表6 回歸模型系數(shù)的顯著性

Tab.6 Significance of regression coefficients for the model

“**”表示差異極顯著(<0.01) ** means highly significant difference (<0.01)

圖9 兩兩因素交互作用3D圖和等高線圖

表7 與其他研究成果的比較

Tab.7 Comparison with other research results

Arima H, Motoyama K, Irie T,. Recent findings on safety profiles of cyclodextrins, cyclodextrin conjugates and polypseudorotaxanes. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, 2011, 32: 91–123

Artiss JD, Brogan K, Brucal M,. The effects of a new soluble dietary fiber on weight gain and selected blood parameters in rats. Metabolism, 2006, 55(2): 195–202

Bharat G, Anant P. Alpha-cyclodextrin production using cyclodextrin glycosyltransferase fromAS-22. Starch Starke, 2001, 53(2): 75–83

Biwer A, Antranikian G, Heinzle E. Enzymatic production of cyclodextrins. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 59(6): 609–617

Dong YJ, Hao JH, Zhang HF,. Optimization of the fermentation conditions for xylanase-producing strain YS1069. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(3): 154–159 [董延娟, 郝建華, 鄭鴻飛, 等. 產(chǎn)木聚糖酶菌株YS1069的產(chǎn)酶條件優(yōu)化. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(3): 154–159]

Duan X, Chen S, Chen J,. Enhancing the cyclodextrin production by synchronous utilization of isoamylase and α-CGTase. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(8): 3467–3474

Guo YH, Chen JC, Cai HS,. Saturated mutation effects on catalytic efficiency and product specificity of starch binding site N623 of cyclodextrin glucanotransferase fromsp. CHB1. China Biotechnology, 2016, 36(11): 30–38 [郭永華, 陳濟(jì)琛, 蔡海松, 等.sp.CHB1環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶淀粉結(jié)合位點(diǎn)N623飽和突變對(duì)催化效率與產(chǎn)物特異性的影響. 中國(guó)生物工程雜志, 2016, 36(11): 30–38]

Jung SW, Kim TK, Lee KW,. Catalytic properties of beta-cyclodextrin glucanotransferase from alkalophilicsp. BL-12 and intermolecular transglycosylation of stevioside. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2007, 12(3): 207–212

Li SJ, Zhou ZR. Application of cyclodextrins in the cosmetic field. Applied Chemical Industry, 2016, 45(10): 1942–1945 [李姝靜, 周自若, 鄧小鋒, 等. 環(huán)糊精在化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用研究. 應(yīng)用化工, 2016, 45(10): 1942–1945]

Mau GK, Muhammad MN, Osman H,. The effects of reaction conditions on the production of γ-cyclodextrin from tapioca starch by using a novel recombinant engineered CGTase. Journal of Molecular Catalysis, B: Enzymatic, 2007, 9(1–4): 118–126

Pishtiyski I, Zhekova B. Effect of different substrates and their preliminary treatment on cyclodextrin production. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, 22(2): 109–114

Valle D, Martin EM. Cyclodextrins and their uses: A review. Process Biochemistry, 2004, 39(9): 1033–1046

Wang Y, Li J, Yang GW,. Study of soluble expression inof-cyclodextringlycosyl transferase produced byandproperties of its derivatives. China Food Additives, 2017(2): 81–86 [王琰, 李皎, 楊國(guó)武, 等. 多黏芽孢桿菌產(chǎn)ɑ-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物特異性研究. 中國(guó)食品添加劑, 2017(2): 81–86]

Zhang HW. Structural characteristics of cyclodextrin and its research status in environmental protection. Environment and Life, 2014(22): 319–320 [張洪偉. 環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)特性及其在環(huán)保領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀. 環(huán)境與生活, 2014(22): 319–320]

Zhang XL, Hao JH, Zhang HF,. Optimized fermentation of α-cyclodextrin glucosyltransferase producing strain. Chinese Journal of Marine Drugs, 2015, 34(5): 63–70 [張曉磊, 郝建華, 鄭鴻飛, 等. 1株產(chǎn)α-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化. 中國(guó)海洋藥物, 2015, 34(5): 63–70]

Zhu Z, Yang M. Evaluation of the effect of high blood fat elimination by alpha cyclodextrin to the clinical biochemical measurement. Sichuan Medical Journal, 2016, 37(9): 1048–1052 [朱征, 楊敏. α-環(huán)糊精消除高脂血對(duì)臨床生化測(cè)定影響的效果評(píng)價(jià). 四川醫(yī)學(xué), 2016, 37(9): 1048–1052]

Optimization of Conversion Process of α-Cyclodextrin with Enzyme Using Response Surface Methodology

CHEN Xiaotong1,2, HUANG Liping1,2, SUN Mi1, HAO Jianhua1①

(1. Key Laboratory of Polar Fisheries Development, Ministry of Agriculture and Rural Affairs; Laboratory for Marine Drugs and Bioproducts, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao); Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 2. College of Food Sciences & Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306)

In order to obtain a higher yield of α-cyclodextrin conversion, we use a single factor experiment and response surface experiment method, to optimize the production of α-cyclodextrin conditions by α-cyclodextrin glucosyltransferase. The enzyme is derived from strain Y112. First, the single factor method was used to screen six factors including substrate species, substrate concentration, enzyme content, reaction time, temperature, and pH. Second, these main variables affecting the conversion of α-cyclodextrin were evaluated with the Plackett-Burman test. The results suggested that substrate concentration, temperature, and pH were the most impactful factors. Finally, the optimal levels of the three factors were determined with central composite design and Design-Expert 8.05 software. The optimum conversion conditions were shown as follows: the concentration of potato starch was 5%, the amount of enzyme 200 U/g (starch), pH 8.4, 200 r/min, reacted at 30℃ for 6 h. Under the optimized conditions, the average value of α-CD conversion was 28.67%, which was an increase of 2.48 times compared with the pre-optimization yield.

α-Cyclodextrin glucosyltransferase; Response surface analysis; α-Cyclodextrin; Conversion process

* 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2018YFC0311100)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室-鰲山科技計(jì)劃(2016ASKJ14)和青島市市南區(qū)科技發(fā)展計(jì)劃(2018-4-002-ZH)共同資助 [This work was supported by National Key R&D Program of China(2018YFC0311100), Aoshan Science & Technology Plan of Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (2016ASKJ14), and Qingdao Shinan Science & Technology Plan (2018-4-002-ZH)]. 陳曉彤，E-mail: cxt1103609717@163.com

郝建華，研究員，E-mail: haojh@ysfri.ac.cn

HAO Jianhua, E-mail: haojh@ysfri.ac.cn

2017-04-27,

2017-08-04

10.19663/j.issn2095-9869.20170427001

陳曉彤, 黃立萍, 孫謐, 郝建華. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化a-環(huán)糊精的酶轉(zhuǎn)化工藝. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 143–151 Chen XT, Huang LP, Sun M, Hao JH. Optimization of conversion process of α-cyclodextrin with enzyme using response surface methodology. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 143–151

S932

A

2095-9869(2018)05-0143-09

(編輯 馮小花)