劉 嬋 馮 娟 謝云丹 胡萬(wàn)濤 王江勇 蘇友祿

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基于毒力基因的羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌三重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用*

劉 嬋1,2馮 娟2謝云丹1,2胡萬(wàn)濤3王江勇2蘇友祿2①

(1. 天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 天津 300384；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州 510300；3. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510006)

無(wú)乳鏈球菌()作為羅非魚(yú)主要病原，傳染力強(qiáng)、致死率高，部分魚(yú)從發(fā)病到死亡無(wú)明顯病癥，難以確定魚(yú)體是否攜帶該病原菌，建立適用于生產(chǎn)一線的無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。根據(jù)GenBank中無(wú)乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶基因()、青霉素結(jié)合蛋白基因()和CAMP因子基因()的保守序列，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，對(duì)多重PCR的反應(yīng)條件和體系進(jìn)行優(yōu)化，建立基于毒力基因的羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌三重PCR檢測(cè)方法，并運(yùn)用該方法檢測(cè)來(lái)自廣東省不同地區(qū)的羅非魚(yú)組織樣品。構(gòu)建的三重PCR檢測(cè)方法僅在無(wú)乳鏈球菌中擴(kuò)增出3條特異性條帶，而在羅非魚(yú)和常見(jiàn)的水產(chǎn)病原菌菌株中均未擴(kuò)增出任何條帶，表現(xiàn)出良好的特異性；以無(wú)乳鏈球菌基因組DNA濃度7.24×10–5~5.65 ng/μl為模板進(jìn)行擴(kuò)增，該三重PCR能檢測(cè)到的最低模板濃度為1.81×10–3ng/μl，表現(xiàn)出較高的靈敏度；運(yùn)用該方法檢測(cè)188個(gè)羅非魚(yú)組織樣品，其陽(yáng)性檢出率與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定陽(yáng)性率一致，以常規(guī)細(xì)菌分離鑒定為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)該三重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，其診斷敏感性(Dse)和診斷特異性(Dsp)均為100%。結(jié)果表明，構(gòu)建的三重PCR檢測(cè)方法不僅顯著提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，還可在同一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)3種無(wú)乳鏈球菌毒力基因，為無(wú)公害水產(chǎn)品中無(wú)乳鏈球菌的快速檢疫、水產(chǎn)養(yǎng)殖病害早期預(yù)警提供了一種快速、精準(zhǔn)和高效的檢測(cè)技術(shù)。

羅非魚(yú)；無(wú)乳鏈球菌；毒力基因；三重PCR

無(wú)乳鏈球菌()也稱(chēng)B簇鏈球菌(Group B streptococci, GBS)，為兼性革蘭氏陽(yáng)性球菌(Rosinski-Chupin, 2013; Soto, 2015)。該菌宿主廣泛，不僅能感染包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，還是養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的重要病原(Schuchat, 1998)。羅非魚(yú)為重要的世界性養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)向全球推廣養(yǎng)殖的優(yōu)良品種，中國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖年產(chǎn)量約為178萬(wàn)t，占世界羅非魚(yú)總產(chǎn)量的三分之一以上，是水產(chǎn)品出口量最大的品種之一(2016中國(guó)漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒)。近年來(lái)，羅非魚(yú)鏈球菌病日益嚴(yán)重，無(wú)乳鏈球菌作為其主要病原，傳染力強(qiáng)，致死率高，由此產(chǎn)生的病害給羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Evans, 2008; Kayansamruaj, 2015)。

羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病發(fā)病較快，部分魚(yú)從發(fā)病到死亡無(wú)明顯病癥，較難確定魚(yú)體是否攜帶該病原菌，從而影響對(duì)病害的有效處理(程世亮等, 2016)。傳統(tǒng)的病原菌分離和生理生化鑒定等方法，由于操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)，不能達(dá)到快速檢測(cè)目的(張新艷等, 2008; 盧邁新等, 2010)；普通PCR方法，一次僅能檢測(cè)1個(gè)基因，可能會(huì)造成漏檢或誤檢(Wu, 2008)；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)方法，具有靈敏度高、反應(yīng)時(shí)間短、臨床使用不需要特殊的儀器、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)引物設(shè)計(jì)要求比較高，有些基因可能不適用，還容易形成氣溶膠污染，造成假陽(yáng)性(甘文佳等, 2010)；熒光定量PCR雖然具有較高的靈敏度，但檢測(cè)儀器昂貴，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)水平要求較高(Su, 2016)。因此，建立快速、精準(zhǔn)、高效且適用于生產(chǎn)一線的無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。

多重PCR在一次反應(yīng)中能同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目的片段的靶序列，具有高效、快捷、高度特異、敏感等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為諸多實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)診斷方法(畢艷妮等, 2014)。目前，多重PCR方法已用于養(yǎng)殖對(duì)蝦中同時(shí)檢測(cè)6種病毒(劉飛等, 2014)。本研究以無(wú)乳鏈球菌的毒力基因即透明質(zhì)酸酶基因編碼表面相關(guān)青霉素結(jié)合蛋白的基因和CAMP因子的基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，通過(guò)引物組合優(yōu)化建立一種快速、高效、穩(wěn)定、特異性好、靈敏度高的無(wú)乳鏈球菌三重PCR檢測(cè)方法，旨在為無(wú)乳鏈球菌的快速檢測(cè)和早期預(yù)警提供一種準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC51487)和人源無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC BAA-1138)購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏中心。來(lái)源于不同年份和地區(qū)的無(wú)乳鏈球菌分離株TZQ0901(2009年分離自廣東省肇慶市)、TGZ1001(2010年分離自廣東省高州市)、TYC1101 (2011年分離自廣東省陽(yáng)春市)、THZ1301(2013年分離自廣東省惠州市惠東區(qū))、GZN1501(2015年分離自廣東省廣州市)、TLC1601(2016年分離自廣東省龍川縣)均從宿主羅非魚(yú)分離獲得，海豚鏈球菌()、美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種(subsp)、糞腸球菌()、金黃色葡萄球菌()、遲緩愛(ài)德華氏菌()、創(chuàng)傷弧菌() 均由實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中無(wú)乳鏈球菌3個(gè)特異性、和基因序列，通過(guò)Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物對(duì)(表1)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3 DNA模板的制備

各實(shí)驗(yàn)菌株的DNA提取按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明，并保存于–20℃?zhèn)溆?。羅非魚(yú)組織中細(xì)菌DNA提取步驟，參照Su等(2016)的方法。首先取魚(yú)組織約50 mg，放入組織勻漿器中研磨，加入1000 μl TE緩沖液，制成組織勻漿液。取上述勻漿液180 μl，加入20 μl濃度為50 mg/ml的溶菌酶，30℃孵育10 min，后續(xù)步驟均參照細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行。即得到高純度的魚(yú)(魚(yú)包括體內(nèi)細(xì)菌)基因組DNA，保存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

表1 3對(duì)引物的信息

Tab.1 The information of the three pairs of primers

1.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化與建立

單一引物擴(kuò)增采用25 μl反應(yīng)體系：2×PCR DsMix 12.5 μl，引物F(10 μmol/L) 1.0 μl，引物R(10 μmol/L) 1.0 μl，DNA模板1.0 μl，ddH2O 9.5 μl。利用3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系組成：2×PCR DsMix 12.5 μl，各引物上、下游(10 μmol/L)分別為0.2~1.0 μl，DNA模板1.0 μl，補(bǔ)充ddH2O至25 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，55~60℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。然后取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物，在恒壓120 V條件下，1%的瓊脂糖凝膠電泳25 min檢測(cè)結(jié)果。其中，無(wú)菌超純水代替DNA模板的擴(kuò)增結(jié)果為陰性對(duì)照。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，選擇最佳的引物比例和退火溫度。同時(shí)，將三重PCR方法所擴(kuò)增的特異性片段送北京六合華大基因科技有限公司(廣州)進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 特異性實(shí)驗(yàn)

分別以魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC51487)、人源無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC BAA-1138)、6株羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌(TZQ0901、TGZ1001、TYC1101、THZ1301、GZN1501和TLC1601)、海豚鏈球菌、美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、創(chuàng)傷弧菌和遲緩愛(ài)德華菌的基因組DNA為模板，根據(jù)優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)條件和體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.6 敏感性實(shí)驗(yàn)

測(cè)定提取的魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC51487)基因組DNA濃度，將樣品濃度按照50、5–1、5–2、5–3、5–4、5–5、5–6和5–7進(jìn)行梯度稀釋后分別為模板DNA，采用優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定三重PCR檢測(cè)方法所需模板的最低濃度。

1.7 應(yīng)用

利用構(gòu)建好的三重PCR方法，檢測(cè)來(lái)自廣東省廉江市、高州市、吳川市、開(kāi)平市、惠城區(qū)和龍川縣6個(gè)不同羅非魚(yú)養(yǎng)殖區(qū)188個(gè)羅非魚(yú)組織樣品。同時(shí)，利用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定法對(duì)每份組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較這2種檢測(cè)方法的結(jié)果。

1.8 無(wú)乳鏈球菌三重PCR檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》(2016)所規(guī)定的原則，在95%以上的置信區(qū)間、允許誤差5%范圍內(nèi)對(duì)188個(gè)羅非魚(yú)組織樣品進(jìn)行檢測(cè)，以常規(guī)細(xì)菌分離鑒定法為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算此三重PCR檢測(cè)方法的診斷敏感性(Dse)和診斷特異性(Dsp)。

2 結(jié)果

2.1 三重PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

分別對(duì)各引物加入體系的體積和退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳退火溫度為57℃，反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果見(jiàn)表2。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)，出現(xiàn)3條特異性條帶；使用單一引物分別擴(kuò)增、和基因，均出現(xiàn)1條特異性條帶，條帶位置與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。此外，對(duì)送測(cè)序的特異性條帶序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與無(wú)乳鏈球菌、和基因的同源性均達(dá)到或超過(guò)99%，表明構(gòu)建的三重PCR所擴(kuò)增的特異性條帶是準(zhǔn)確的。

表2 三重PCR反應(yīng)體系試劑組成

Tab.2 The content of the reagent in the reaction system of a triple PCR

圖1 3對(duì)引物和單一引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

M: DL2000 bp marker；1：三重PCR的結(jié)果；2~4分別表示、和基因的擴(kuò)增片段；5：陰性

M: DL2000 bp marker; Lane 1: the result of three pairs of primers; Lanes 2~4:Amplified fragments of,, and; Lane 5:Negative control

2.2 特異性檢測(cè)

特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌(ATCC51487)、人源無(wú)乳鏈球菌(ATCC BAA-1138)以及不同年份和地區(qū)的無(wú)乳鏈球菌分離株擴(kuò)增結(jié)果一致，均擴(kuò)增出3條目的條帶。而以羅非魚(yú)、美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、遲緩愛(ài)德華氏菌、海豚鏈球菌、創(chuàng)傷弧菌的基因組DNA為模板均未擴(kuò)增出任何條帶，與陰性對(duì)照結(jié)果相一致(圖2)。

圖2 三重PCR特異性檢測(cè)結(jié)果

M：DL2000 bp marker；1：魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌(ATCC51487)；2：人源無(wú)乳鏈球菌(ATCC BAA-1138)；3：羅非魚(yú)基因組；4：美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種；5：糞腸球菌；6：金黃色葡萄球菌；7：遲緩愛(ài)德華氏菌；8：海豚鏈球菌；9：創(chuàng)傷弧菌；10~15：擴(kuò)增使用的模板為T(mén)ZQ0901、TGZ1001、TYC1101、THZ1301、GZN1501和TLC1601；16：陰性對(duì)照

M: DL2000 bp marker; Lane 1:ATCC51487; Lane 2:ATCC BAA-1138; Lane 3: Tilapia genomic DNA; Lane 4:subsp; Lane 5:; Lane 6:; Lane 7:; Lane 8:; Lane 9:; Lanes 10~15: TZQ0901, TGZ1001, TYC1101, THZ1301, GZN1501, and TLC1601 of; Lane 16: Negative control

2.3 靈敏性檢測(cè)

以無(wú)乳鏈球菌基因組DNA濃度分別為5.65、1.13、2.26×10–1、4.52×10–2、9.04×10–3、1.81×10–3、3.62×10–4和7.24×10–5ng/μl為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，三重PCR能檢測(cè)到的無(wú)乳鏈球菌基因組DNA最低濃度為1.81×10–3ng/μl(圖3)。

圖3 三重PCR敏感性檢測(cè)結(jié)果

M：DL2000 bp marker；1~8：無(wú)乳鏈球菌模板濃度分別為5.65、1.13、2.26×10–1、4.52×10–2、9.04×10–3、1.81×10–3、3.62×10–4和7.24×10–5ng/μl；9：陰性對(duì)照

M: DL2000 bp marker; Lanes 1~8: Template concentration ofas 5.65, 1.13, 2.26×10–1, 4.52×10–2, 9.04×10–3, 1.81×10–3, 3.62×10–4, and 7.24×10–5ng/μl; Lane 9: Negative control

2.4 三重PCR檢測(cè)方法的應(yīng)用

采自廉江、龍川、高州、吳川、開(kāi)平和惠東的羅非魚(yú)樣品陽(yáng)性檢出率分別為100%(4/4)、100%(8/8)、57.14%(4/7)、50%(2/4)、1.23%(2/159)和0(0/6)；總體來(lái)看，188尾羅非魚(yú)組織樣品的陽(yáng)性檢出率為10.6% (20/188)，均與常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)果相一致(表3)。

2.5 三重PCR檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)結(jié)果

以常規(guī)細(xì)菌分離鑒定方法為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)Dse和Dsp計(jì)算公式得出本研究所建立的三重PCR檢測(cè)方法的Dse和Dsp均為100%(表4)。

3 討論

羅非魚(yú)是我國(guó)主要的水產(chǎn)品養(yǎng)殖和出口品種之一，近幾年，由于羅非魚(yú)產(chǎn)品不合格(農(nóng)獸藥殘留、品質(zhì)不合格、微生物污染、食品添加劑超標(biāo)等)，出口嚴(yán)重受阻(趙海軍等, 2015)。其中，由無(wú)乳鏈球菌帶來(lái)的病害給羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的損失最為嚴(yán)重。水產(chǎn)品中微生物的檢測(cè)方法主要有生化培養(yǎng)法、免疫學(xué)法和核酸檢測(cè)法等(應(yīng)曉國(guó)等, 2017)，王遠(yuǎn)微等(2008)利用三重PCR對(duì)臨床疑似樣本的檢出率為81.8%，對(duì)人工攻毒樣本的檢出率為87.5%，兩組數(shù)據(jù)均高于用細(xì)菌分離的檢出率(40.9%和67.5%)，說(shuō)明多重PCR可避免單個(gè)毒力基因進(jìn)行檢測(cè)時(shí)漏檢情況的發(fā)生，同時(shí)也暗示多重PCR比細(xì)菌分離技術(shù)更靈敏。

表3 組織樣品檢測(cè)結(jié)果

Tab.3 The detection result of the tissue samples

表4 兩種不同的方法對(duì)組織樣品的檢測(cè)

Tab.4 Two different methods for detection of the tissue samples

基于PCR技術(shù)的無(wú)乳鏈球菌檢測(cè)方法大多選取靶標(biāo)基因?yàn)?6S~23S rRNA間區(qū)序列、sip和莢膜多糖類(lèi)編碼基因等(王均等, 2011; Forsman, 1997)。無(wú)乳鏈球菌普遍存在20多種毒力基因(Lin, 2011)，透明質(zhì)酸酶(Hyl)是無(wú)乳鏈球菌重要的毒力因子，有助于鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并影響巨噬細(xì)胞促炎性因子的表達(dá)，在無(wú)乳鏈球菌致病過(guò)程中起關(guān)鍵作用(Wang, 2014)。青霉素結(jié)合蛋白(PBP1a)在GBS抗吞噬清除中起重要作用(Hamilton, 2006; Jones, 2000)，蔡朝陽(yáng)等(2006)發(fā)現(xiàn)青霉素結(jié)合蛋白的改變與金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林等β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素以及萬(wàn)古霉素等糖肽類(lèi)抗生素耐藥有密切關(guān)系，影響藥物作用的靶位，阻止抗生素的殺菌作用。CAMP因子認(rèn)為是具有成孔性質(zhì)的分泌蛋白，在GBS致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Udo, 2013)。通過(guò)基因組的數(shù)據(jù)檢索確認(rèn)，不同來(lái)源的(包括人及其他動(dòng)物源)無(wú)乳鏈球菌均包含上述3種毒力基因，說(shuō)明它們?cè)诓≡w的侵入、繁殖與擴(kuò)散及抵抗機(jī)體防御中起關(guān)鍵作用(Casadevall, 2001)，因此，選擇、和毒力基因設(shè)計(jì)引物檢測(cè)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌十分必要。

多重PCR方法具有特異性好、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)病原的檢測(cè)。曾偉偉等(2013)針對(duì)草魚(yú)呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV)各類(lèi)型毒株的保守序列，建立了GCRV的三重PCR檢測(cè)方法；危芙蓉等(2010)根據(jù)廣州管圓線蟲(chóng)核糖體小亞基基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，并與小管福壽螺的特異性引物組合，建立了檢測(cè)小管福壽螺體內(nèi)廣州管圓線蟲(chóng)的多重PCR方法；李晨等(2010)根據(jù)水產(chǎn)上常見(jiàn)病原菌鰻弧菌()、嗜水氣單胞菌()、遲緩愛(ài)德華氏菌()的毒力相關(guān)基因，建立了同時(shí)檢測(cè)3種菌的單管多重PCR方法。本研究中，用單一引物分別擴(kuò)增、和基因，可獲得特異性擴(kuò)增條帶，將上述3對(duì)引物組合并優(yōu)化出多重PCR條件和體系，可同時(shí)擴(kuò)增出3條特異性條帶。Su等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，以無(wú)乳鏈球菌的一些毒力基因(如和)為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，存在跟其他病原菌基因組DNA交叉反應(yīng)的現(xiàn)象，而本研究中未能在其他水產(chǎn)動(dòng)物病原菌基因組中擴(kuò)增出條帶，表明所建立的三重PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。靈敏度測(cè)試發(fā)現(xiàn)，本研究所構(gòu)建的方法可檢測(cè)到濃度為1.81×10–3ng/μl的細(xì)菌基因組DNA，比黃錦爐等(2012)構(gòu)建的三重PCR檢測(cè)方法靈敏度提高了近200倍。運(yùn)用本研究構(gòu)建的三重PCR方法檢測(cè)廣東省各地區(qū)羅非魚(yú)組織樣品的陽(yáng)性檢出率為10.6%(20/188)，與細(xì)菌分離鑒定的結(jié)果吻合，說(shuō)明三重PCR在羅非魚(yú)樣品檢測(cè)過(guò)程中具有廣闊的應(yīng)用前景。該三重PCR檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏度高，為羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病的診斷、大規(guī)模檢疫、流行病學(xué)調(diào)查等提供了一種快速、準(zhǔn)確而有效的方法。

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The Application and Detection ofIsolated from Tilapia with a Triple PCR Based on Virulence Genes

LIU Chan1,2, FENG Juan2, XIE Yundan1,2, HU Wantao3, WANG Jiangyong2, SU Youlu2①

(1. College of Fisheries, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384; 2. Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300; 3. School of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006)

has become one of the most important emerging pathogens with strong infectivity and virulence, causing high mortalities and large economic losses in tilapia farming industries in China. There are no obvious symptoms in some tilapia infected by, so it can be difficult to determine if a fish carried the pathogen. Thus, it was necessary to establish an effective method for detection ofin the breeding process of tilapia. Three pairs of specific primers were designed based on the conserved sequence of, andgenes encoding hyaluronidase, penicillin binding protein, and CAMP factor ofpublished in GenBank, respectively. After the optimization of the reaction conditions and reaction system of multiplex PCR, the triple PCR method based on the three virulence genes was developed for detection ofisolated from tilapia. Furthermore, the established method was applied to detect tissue samples of tilapia collected from different farming areas in Guangdong Province. The detection result ofonly amplified three specific bands, however there were no bands in the host and the other common bacterial pathogen strains in aquaculture, which indicated that the method had good specificity. The dynamic range of template concentration ofwas 7.24×10-5~5.65 ng/μl. Sensitivity tests showed that the detection limit of thein genomic DNA was 1.81×10-3ng/μl, with a higher sensitivity. The positive rate for detection of 188 tissue samples isolated from tilapia using the triple PCR method was consistent with the positive rate by the conventional bacterial identification method. The triple PCR method was evaluated with the conventional method as the standard; diagnostic sensitivity (Dse) and diagnostic specificity (Dsp) were 100%. In summary, the results showed that the triple PCR method not only improved the accuracy and sensitivity of the detection, but also detected three virulence genes ofin the same reaction system. Therefore, this method provided a rapid, accurate, and efficient detection technology for monitoringinfection in harmless aquatic products and early warning of aquaculture diseases.

Tilapia;; Virulence gene; Triple PCR

* 國(guó)家自然科學(xué)基金(31502210)、廣州市珠江科技新星(201610010015)、廣東省級(jí)魚(yú)病防治專(zhuān)項(xiàng)(2016-302)、廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313688)和“廣東特支計(jì)劃”科技青年拔尖人才(2016TQ03N275)共同資助 [This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31502210), Pearl River S&T Nova Program of Guangzhou (201610010015), Special Funds for Fish Diseases of Guangdong Province (2016-302), Natural Science Foundation of Guangdong Province (2015A030313688), and Youth Science and Technology Innovation Talents Funds in Special Support Plan for High Level Talents in Guangdong Province (2016TQ03N275)]. 劉 嬋, E-mail: 784102490@qq.com

蘇友祿，副研究員，E-mail: suyoulu@scsfri.ac.cn

SU Youlu, E-mail: suyoulu@scsfri.ac.cn

2017-07-07,

2017-07-31

10.19663/j.issn2095-9869.20170707001

劉嬋, 馮娟, 謝云丹, 胡萬(wàn)濤, 王江勇, 蘇友祿. 基于毒力基因的羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌三重PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(5): 130–136 Liu C, Feng J, Xie YD, Hu WT, Wang JY, Su YL. The application and detection ofisolated from tilapia with a triple PCR based on virulence genes. Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(5): 130–136

S942

A

2095-9869(2018)05-0130-07

(編輯 馮小花)