趙琳琳　張鑫喆　徐方旭

摘 要：采用酶解法獲取蛹蟲草子實體中的多肽，并對中性蛋白酶和木瓜蛋白酶提取出的蛹蟲草多肽進(jìn)行體外抗氧化活性的測定。結(jié)果表明，蛹蟲草多肽具有一定的還原能力、清除DPPH的能力和清除羥自由基的能力，并且采用木瓜蛋白酶提取出的多肽活性均優(yōu)于用中性蛋白酶提取出的多肽。這為以后蛹蟲草多肽在醫(yī)學(xué)、食品及保健品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用提供了重要理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草；多肽；蛋白酶；抗氧化

DOI：10.16640/j.cnki.37-1222/t.2018.19.041

0 引言

蛹蟲草[Cordyceps militaris（L.）Link]是一種和冬蟲夏草同屬異種的藥食兼用真菌，又名北冬蟲夏草。研究表明蛹蟲草含有與冬蟲夏草相近的功能物質(zhì)及藥用功效[1]。蛹蟲草含有蛋白質(zhì)、蟲草酸、脂肪、SOD酶、蟲草素、蟲草多糖和很多微量元素。眾所周知，多肽是機(jī)體完成各種生理活性必不可少的一種物質(zhì)，在生物的代謝活動和疾病治療中也有著舉足輕重的作用，因此該研究現(xiàn)已成為一大熱點[2]。但目前國內(nèi)外的學(xué)術(shù)研究，有關(guān)蛹蟲草多肽內(nèi)容的很少，大部分都圍繞蟲草素和蟲草多糖的研究。本文對蛹蟲草子實體中多肽的提取、及體外抗氧化活性進(jìn)行研究，旨在為日后蛹蟲草多肽類物質(zhì)的研究及其應(yīng)用提供參考意見。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實體、30%過氧化氫溶液、無水乙醇、硫酸亞鐵、水楊酸、蒸餾水、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、DPPH、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶。

1.2 儀器設(shè)備

粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋、分光光度計、離心機(jī)、電子天平、篩子、錐形瓶等。

2 實驗方法

2.1 多肽的提取

將蛹蟲草磨成粉用篩子過濾后，取6個150ml錐形瓶加入10 g蟲草粉、90ml蒸餾水，三個分別加0.5 g木瓜蛋白酶和中性蛋白酶，室溫下充分溶脹30min后放入恒溫水浴鍋中3 h，調(diào)節(jié)溫度為55 ℃和50 ℃。酶解完成后沸水浴煮沸10 min，離心（4000 r/min）10 min得上清即為肽類物質(zhì)。

2.2 蛹蟲草多肽體外抗氧化活性研究

2.2.1 蛹蟲草多肽對羥自由基清除能力的測定

采用水楊酸法測定。取1.0mL待測液于試管中，分別加入0.2mL過氧化氫溶液，0.2mL硫酸亞鐵溶液，0.2mL水楊酸-乙醇溶液和3.4mL蒸餾水，振蕩搖勻放后在37℃的恒溫水浴鍋內(nèi)30min后拿出?？瞻捉M為蒸餾水，對照組為不加待測液的反應(yīng)液。將分光光度計波長調(diào)為510nm，分別測定對照組和待測液的吸光值。每個實驗重復(fù)三次。

羥自由基（-OH）清除率的計算公式為：E-OH=（A對照-A樣品）/A對照×100%

2.2.2 蛹蟲草多肽還原力測定

采用鐵氰化鉀還原法測定。取1.0mL待測液于試管中分別加入2.5mL磷酸緩沖液（PH7.0）、1.5mL蒸餾水、2.5mL鐵氰化鉀溶液。振蕩搖勻后在50℃的恒溫水浴鍋內(nèi)20分鐘后迅速拿出冷卻。再加入2.5mL三氯乙酸溶液，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL放入新試管中，加入2.5蒸餾水和0.5mL三氯化鐵溶液，充分混勻后常溫下靜置10min。將分光光度計波長調(diào)為700nm，測定吸光值。吸光值越大，說明測定物的還原力越強(qiáng)。每個實驗重復(fù)三次。

2.2.3 蛹蟲草多肽對DPPH自由基清除能力的測定

取1.0mL待測液于試管中，分別加入1.5mLDPPH溶液、1.5mL蒸餾水，振蕩搖勻后在25℃的恒溫水浴鍋內(nèi)30min后拿出。空白組為1.5mL無水乙醇和1.5mL蒸餾水混合均勻后的反應(yīng)液。對照組為1.5mLDPPH溶液和1.5mL蒸餾水混合均勻后的反應(yīng)液。將分光光度計波長調(diào)為517nm，分別測定對照組和待測液的吸光值。每個實驗重復(fù)三次。

DPPH自由基清除率的計算公式：EDPPH=（A對照-A樣品）/A對照×100%

3 結(jié)果與分析

3.1 蛹蟲草多肽對羥自由基清除能力

從圖1可以看出，蛹蟲草多肽對羥自由基具有一定的清除能力。從三次的測定結(jié)果來看，木瓜蛋白酶提取的蛹蟲草多肽對于羥自由基的清除能力均要好于中性蛋白酶提取的蛹蟲草多肽，從平均值可以看出，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶提取的蛹蟲草多肽對于羥自由基的清除能力分別為66.1%和52.7%。由此可見，木瓜蛋白酶更適合于蛹蟲草多肽的提取。

3.2 蛹蟲草多肽還原力

從圖2可以看出，蛹蟲草多肽具有一定的還原能力。從三次的測定結(jié)果來看，木瓜蛋白酶提取的蛹蟲草多肽還原能力均要好于中性蛋白酶提取的蛹蟲草多肽。木瓜蛋白酶提取出的蛹蟲草多肽還原力吸光值平均值為2.60，中性蛋白酶提取出的蛹蟲草多肽還原力吸光值平均值為0.190。由此可見，木瓜蛋白酶更適合于蛹蟲草多肽的提取。

3.3 蛹蟲草多肽對DPPH自由基清除能力

從圖3可以看出，蛹蟲草多肽對DPPH自由基具有一定的清除能力。從三次的測定結(jié)果來看，木瓜蛋白酶提取的蛹蟲草多肽對于羥自由基的清除能力均要好于中性蛋白酶提取的蛹蟲草多肽，從平均值可以看出，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶提取的蛹蟲草多肽對于羥自由基的清除能力分別為89.1%和88.2%。由此可見，木瓜蛋白酶更適合于蛹蟲草多肽的提取。

4 結(jié)論

從上述蛹蟲草多肽體外抗氧化活性測定的三個實驗結(jié)果，可以看出用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶提取出的蛹蟲草多肽都具有一定的對羥自由基的清除能力、還原能力以及對DPPH自由基的清除能力。并且用木瓜蛋白酶提取出的蛹蟲草多肽，上述這三種能力都優(yōu)于中性蛋白酶提取出的蛹蟲草多肽。由此可見，用木瓜蛋白酶提取出的蛹蟲草多體外抗氧化活性更強(qiáng)，說明木瓜蛋白酶比中性蛋白酶更適合于對蛹蟲草多肽的提取。

參考文獻(xiàn)：

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[S].上海：上海人民出版社，1975：

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[2]李衛(wèi)林，湯克勇，曹鍵.生物活性多肽的應(yīng)用研究[J].糧食加工，2005（02）：45-47.

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[4]徐鴻雁.蛹蟲草多肽的制備及分離[D].西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013.

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