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        基因芯片與液體快速培養(yǎng)技術診斷耐藥結核病的對照性分析

        2018-11-12 08:19:12王小路劉光初胡群芳史安良雷建平熊國亮
        現(xiàn)代醫(yī)院 2018年9期
        關鍵詞:基因芯片異煙肼利福平

        王小路 梅 敏 劉光初 胡群芳 史安良 雷建平 熊國亮

        結核病在臨床上較為常見,是一種多發(fā)傳染性疾病,會給人類身心健康和生命安全造成不利影響[1]。特點是耐多藥結核病的出現(xiàn),會增加治療難度,提升病死率[2-3]。當前,臨床上對耐藥結核病的研究不斷深入,認為結核分枝桿菌藥物作用靶點基因點突變在耐藥結核病發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[4]。而臨床上采取積極措施進行結核分枝桿菌及藥物敏感性檢測,能指導耐藥結核病早期診斷和治療。以往,臨床上多采用液體快速培養(yǎng)技術檢測結核分枝桿菌及耐藥性,但也具有檢測時間長等弊端,應用有限[5]。故需尋找更為快速、有效、敏感的結核分枝桿菌及耐藥檢測技術,以指導臨床治療方案制定,改善患者預后。近年來,人們開始越來越多地關注基因芯片技術在耐藥結核病診斷中的應用,認為其能有效檢測常用抗癆藥物敏感性[6-7]。但臨床上針對耐藥結核病診斷中基因芯片技術應用的研究仍較少,且大多不夠深入。本次研究重點對比分析了耐藥結核病診斷中基因芯片、液體快速培養(yǎng)技術的應用效果,現(xiàn)報道如下。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象

        所選研究對象為2016年4月—2017年4月本院結核病科收治的100例結核病患者。納入標準:①慢性排菌或復治失??;②初治失??;③痰涂片陽性;④資料完整。排除標準:①資料不完整;②耐藥檢測失敗。本組患者中,男78例,女22例;年齡18~70歲,平均年齡(56.15±5.40)歲,其中16例為18~39歲,32例為40~59歲,52例為60~70歲。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

        1.2 方法

        1.2.1 儀器與試劑 所用儀器包括BioHermes公司生產(chǎn)的結核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基、Jouan公司生產(chǎn)的離心機、BD公司的結核培養(yǎng)儀BACTEC MGIT-960、康圣環(huán)球醫(yī)學技術有限公司的基因芯片閱讀儀、北京博奧生物有限公司Slide Washer TM8芯片洗干儀及BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Bio-Rad公司的核酸電泳槽及電泳儀等。所用試劑包括康圣環(huán)球醫(yī)學技術有限公司生產(chǎn)的結核分枝桿菌耐藥突變基因試劑盒、上海生工生物工程股份有限公司的瓊脂糖、溴化乙錠等。

        1.2.2 留取痰液標本 指導患者留取膿性粘液樣、干酪樣或膿樣痰液,痰液樣本在室溫下放置時間<24 h,2~8℃環(huán)境下保存時間<1周。

        1.2.3 液體快速培養(yǎng)技術 根據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作規(guī)程及質(zhì)量保證手冊》[8]16-34處理結核菌培養(yǎng)標本,并進行培養(yǎng)。步驟:取10 mL痰液,置于50 mL離心管,準確標記;加入<10 mL等量2% NALC-NaOH前處理液,漩渦振蕩,持續(xù)20 s;室溫下靜置15 min;加入無菌PBS液,直至達到50 mL,離心3 000 g,持續(xù)15 min,取上清液;加入PBS液1~3 mL,中和PH,直至達6.8;標本處理后,接種到培養(yǎng)管實施液體培養(yǎng)。

        1.2.4 藥敏試驗 液體快速培養(yǎng)法分離的陽性菌株,根據(jù)《結核分枝桿菌藥物敏感性試驗標準化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[8]15-28,通過微孔板比例法,分別與一線藥物利福平、異煙肼進行藥敏試驗。

        1.2.5 基因芯片法 根據(jù)結核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒說明書提取痰樣DNA,并進行PCR擴增、雜交、芯片處理及結果評估等。步驟:①取痰樣DNA:取1 mL痰樣,加入等量4% NaOH液化,13 000 r/min離心,持續(xù)5 min,棄上清液,取沉淀;以1 mL M洗液加入沉淀,混勻,10 000 r/min離心,持續(xù)2 min,棄上清液;以50 μL,裂解液加入沉淀,混勻,沸水處理10 min,10 000 r/min離心,持續(xù)2 min,取上清液。②PCR擴增:取標記好的PCR反應管,5 000 rpm離心,持續(xù)2 s,加入4 μL已提取待測樣品DNA。取兩個PCR反應管,分別加入M陰性、陽性質(zhì)控品DNA。擴增條件:50℃條件下持續(xù)2 min,95℃條件下持續(xù)10 min,95℃條件下持續(xù)45 s,共20 cycles循環(huán)數(shù);64℃條件下持續(xù)60 s,95℃條件下持續(xù)30 s,56℃條件下持續(xù)30 s,共30 cycles循環(huán)數(shù);68℃條件下持續(xù)45 s,68℃條件下持續(xù)5 min。③雜交:將標有患者編號的膜條置入15 mL塑料離心管,加5~6 mL AT液、25 μg PCR產(chǎn)物,混勻;沸水加熱10 min;離心管置入分子雜交箱,59℃條件下持續(xù)1.5 h;取50 mL塑料管,以40 mL B液加入,在分子雜交箱中預熱,直至59 ℃。同步處理陰性與陽性質(zhì)控品。④洗膜:膜條取出,轉(zhuǎn)移到預熱至59℃的B液塑料管中,輕搖洗滌,持續(xù)15 min;根據(jù)2 000∶1比例處理AT液、POD,配置孵育液,持續(xù)30 min;棄POD液;室溫下AT液輕搖2次,15 min/次;室溫下,C液洗膜,持續(xù)2 min;配置顯色液,置入膜條,避光顯色,持續(xù)5~10 min,觀察結果。經(jīng)由檢測利福平、異煙肼位點突變情況分析其耐藥型?;蛐酒结樋蓹z測利福平耐藥相關基因rpoB 6個位點突變(S531W、D516G、D516V、H526D、S531L、H526Y)及異煙肼耐藥相關基因katG 315位密碼子等。檢測耐藥基因為野生型,即為相應藥物敏感;檢測耐藥基因為突變型,即為相應藥物耐藥。

        1.3 觀察指標

        ①以液體快速培養(yǎng)技術為金標準,判斷基因芯片診斷結核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值。其中,敏感度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100.0%;特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100.0%;陽性預測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100.0%;陰性預測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100.0%。②以藥敏試驗結果為金標準,判斷基因芯片診斷結核分枝桿菌對利福平、異煙肼的耐藥檢出情況。

        1.4 統(tǒng)計學分析

        以SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)資料?;颊咝詣e、特異度、敏感度等計數(shù)資料用2檢驗?;颊吣挲g等計量資料以表示,以t檢驗。不同方法檢測結果一致性采用Kappa檢驗,Kappa值<0.4為一致性較差,0.4≤Kappa值<0.75為一致性較好,Kappa值≥0.75為一致性較高。P<0.05表示有統(tǒng)計學差異。

        2 結果

        2.1 基因芯片法與液體快速培養(yǎng)法檢測結核分枝桿菌結果

        以液體快速培養(yǎng)法為標準,基因芯片檢測結核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為81.67%(49/60)、95.00%(38/40)、96.08%(49/51)、77.55%(38/49)。Kappa檢驗顯示兩者一致性較高(Kappa值=0.77)。

        2.2 基因芯片法與液體快速培養(yǎng)法對結核分枝桿菌陽性檢出率對比

        基因芯片法、液體快速培養(yǎng)法檢測整體陽性率分別為50.00%(50/100)、58.00%(58/100),差異無統(tǒng)計學意義(2=1.288,P=0.256)。

        2.3 基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性

        本組100例痰標本經(jīng)液體快速培養(yǎng)技術,結果顯示結核分枝桿菌菌株陽性58例,均實施藥敏試驗。以58例標本藥敏試驗檢測利福平、異煙肼耐藥結果為標準,基因芯片法檢測利福平耐藥敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為77.78%、97.96%、87.50%、96.00%,Kappa檢驗顯示兩者一致性較高(Kappa值=0.79);基因芯片檢測異煙肼耐藥敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為80.00%、100.00%、100.00%、96.00%,Kappa檢驗顯示兩者一致性較高(Kappa值=0.82)。見表1。

        表1 基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性分析 (n,%)

        3 討論

        作為臨床上一種常見慢性感染性疾病,結核病主要由結核分枝桿菌感染造成,臨床特征為干酪樣壞死、肉芽組織增生,極易累及人體多個器官,其中最常見為肺組織[9]。結核病又被稱為“癆病”、“白色瘟疫”等,發(fā)病歷史悠久,且病死率高。直至人類發(fā)現(xiàn)結核分枝桿菌在結核病發(fā)生中的作用,才開始進行有效結核病防治[10-11]。特別是近年來,隨著利福平、異煙肼抗結核化療藥物的應用,結核病病情明顯得到控制。但受國內(nèi)人口數(shù)量增多、人口流動、人類免疫缺陷病毒感染等因素影響,結核病疫情仍然較為嚴重。特別是近年來,耐藥性結核病發(fā)病人數(shù)不斷增多,治療難度大,病死率高。故需深入分析結核分枝桿菌耐藥機制及特點,尋找快速、準確的方法檢測結核分枝桿菌,以指導早期診斷和治療,合理控制疫情。

        當前,臨床上檢測結核分枝桿菌耐藥的方法較多,包括DNA直接測序技術、聚合酶聯(lián)反應-單鏈構象多態(tài)性分析、基因芯片、培養(yǎng)法等。其中,DNA直接測序技術在某些結核分枝桿菌耐藥性基因突變診斷中有重要作用,但也具有價格昂貴等弊端[12]。聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性分析無需特殊儀器、試劑,技術條件較為成熟,且不會導致出現(xiàn)放射性污染,檢測陽性率高[13]。但檢測過程中也極易受檢測DNA片段長度、膠濃度、緩沖液力度強度、電泳溫度等因素影響,且僅適用于篩選基因突變,應用受限。液體培養(yǎng)法加藥敏試驗是結核病診斷金標準,但也具有耗時時間長、程序繁瑣、重復性差等弊端,往往需要4~8周才能獲得檢測結果,影響結核病,特別是耐藥結核病的早期診斷和治療[14]。近年來,人們開始越來越多地關注基因芯片法在結核病診斷中的應用,該方法是在玻璃等固相載體上,以高密度方式固定生物信息分子,將待測樣本的DNA或RNA與探針雜交,通過特定儀器顯色及掃描,量化分析雜交結果,從而獲得檢測信息[15-17]。在分子突變檢測中,基因芯片技術不僅能對突變位點、突變類型進行明確,還能同時檢測多個基因甚至整個基因組的突變,且具有特異度高等特點。近年來,隨著臨床上對結核分枝桿菌耐藥相關基因及突變位點研究的不斷深入,結核分枝桿菌耐藥檢測中基因芯片技術的應用開始引起人們的高度關注。陳蕾[18]調(diào)查發(fā)現(xiàn),結核病診斷中基因芯片法應用價值較高,能快速檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥的常見突變位點,且能對非結核分枝桿菌屬進行鑒別診斷。

        本次研究以液體快速培養(yǎng)法為標準,判斷基因芯片法檢測結核分枝桿菌的效果。結果發(fā)現(xiàn),以液體快速培養(yǎng)法為標準時,基因芯片檢測結核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為81.67%、95.00%、96.08%、77.55%,具有較高一致性。但本研究結果與董永康等[19]調(diào)查的敏感度92.3%、特異度100.00%存在偏差,考慮與標準選擇不同、標本類型及質(zhì)量等因素有關。本次研究所選標本類型均為痰液標本,細菌數(shù)量可能較纖維支氣管鏡沖洗液低,故今后仍需加大研究力度,聯(lián)合應用痰標本和纖維支氣管鏡標本進行檢測?;蛐酒z測結核分枝桿菌整體陽性率為50.00%,液體快速培養(yǎng)法則為58.00%,漏檢原因可能與實驗人員過早判讀菌落生長結果、受試菌株生長狀態(tài)等有關。此外,本次研究還重點分析了基因芯片法檢測利福平、異煙肼耐藥性。黃海濱等[20]調(diào)查發(fā)現(xiàn),基因芯片技術能有效檢測結核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥情況,且便于判斷katG、inhA、oxyR-ahpC以及rpoB基因突變位置。本次研究以藥敏試驗為標準,發(fā)現(xiàn)基因芯片法檢測利福平、異煙肼的耐藥敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為77.78%、97.96%、87.50%、96.00%和80.00%、100.00%、100.00%、96.00%,Kappa檢驗顯示一致性較高。陳林等[21]調(diào)查分析了結核病耐多藥快速檢測中基因芯片技術的應用效果,并對比羅氏培養(yǎng)法,發(fā)現(xiàn)基因芯片技術對異煙肼耐藥檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為80.2%、95.9%、71.8%、97.4%,對利福平耐藥檢測靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為86.42%、97.5%、80.9%、98.3%。從中可以發(fā)現(xiàn),本次研究利福平耐藥敏感度、陽性預測值較陳林等人報道低,且異煙肼耐藥特異度、陽性預測值較其報道高。筆者認為,這一差異可能與該研究痰涂陽肺結核增加耐藥表型敏感度等因素有關。總體來說,基因芯片對利福平、異煙肼耐藥檢測的敏感度和特異度均較高,與藥敏試驗一致性較高,提示其具有良好應用價值。

        綜上所述,基因芯片法在結核病結核分枝桿菌檢測及耐藥性診斷中具有較高應用價值,需引起高度關注。

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