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        基因芯片與液體快速培養(yǎng)技術(shù)診斷耐藥結(jié)核病的對照性分析

        2018-11-12 08:19:12王小路劉光初胡群芳史安良雷建平熊國亮
        現(xiàn)代醫(yī)院 2018年9期
        關(guān)鍵詞:基因芯片異煙肼利福平

        王小路 梅 敏 劉光初 胡群芳 史安良 雷建平 熊國亮

        結(jié)核病在臨床上較為常見,是一種多發(fā)傳染性疾病,會給人類身心健康和生命安全造成不利影響[1]。特點是耐多藥結(jié)核病的出現(xiàn),會增加治療難度,提升病死率[2-3]。當(dāng)前,臨床上對耐藥結(jié)核病的研究不斷深入,認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌藥物作用靶點基因點突變在耐藥結(jié)核病發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用[4]。而臨床上采取積極措施進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌及藥物敏感性檢測,能指導(dǎo)耐藥結(jié)核病早期診斷和治療。以往,臨床上多采用液體快速培養(yǎng)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌及耐藥性,但也具有檢測時間長等弊端,應(yīng)用有限[5]。故需尋找更為快速、有效、敏感的結(jié)核分枝桿菌及耐藥檢測技術(shù),以指導(dǎo)臨床治療方案制定,改善患者預(yù)后。近年來,人們開始越來越多地關(guān)注基因芯片技術(shù)在耐藥結(jié)核病診斷中的應(yīng)用,認(rèn)為其能有效檢測常用抗癆藥物敏感性[6-7]。但臨床上針對耐藥結(jié)核病診斷中基因芯片技術(shù)應(yīng)用的研究仍較少,且大多不夠深入。本次研究重點對比分析了耐藥結(jié)核病診斷中基因芯片、液體快速培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用效果,現(xiàn)報道如下。

        1 資料與方法

        1.1 研究對象

        所選研究對象為2016年4月—2017年4月本院結(jié)核病科收治的100例結(jié)核病患者。納入標(biāo)準(zhǔn):①慢性排菌或復(fù)治失??;②初治失??;③痰涂片陽性;④資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①資料不完整;②耐藥檢測失敗。本組患者中,男78例,女22例;年齡18~70歲,平均年齡(56.15±5.40)歲,其中16例為18~39歲,32例為40~59歲,52例為60~70歲。本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

        1.2 方法

        1.2.1 儀器與試劑 所用儀器包括BioHermes公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)基、Jouan公司生產(chǎn)的離心機(jī)、BD公司的結(jié)核培養(yǎng)儀BACTEC MGIT-960、康圣環(huán)球醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司的基因芯片閱讀儀、北京博奧生物有限公司Slide Washer TM8芯片洗干儀及BioMixerTMⅡ芯片雜交儀、Bio-Rad公司的核酸電泳槽及電泳儀等。所用試劑包括康圣環(huán)球醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥突變基因試劑盒、上海生工生物工程股份有限公司的瓊脂糖、溴化乙錠等。

        1.2.2 留取痰液標(biāo)本 指導(dǎo)患者留取膿性粘液樣、干酪樣或膿樣痰液,痰液樣本在室溫下放置時間<24 h,2~8℃環(huán)境下保存時間<1周。

        1.2.3 液體快速培養(yǎng)技術(shù) 根據(jù)《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程及質(zhì)量保證手冊》[8]16-34處理結(jié)核菌培養(yǎng)標(biāo)本,并進(jìn)行培養(yǎng)。步驟:取10 mL痰液,置于50 mL離心管,準(zhǔn)確標(biāo)記;加入<10 mL等量2% NALC-NaOH前處理液,漩渦振蕩,持續(xù)20 s;室溫下靜置15 min;加入無菌PBS液,直至達(dá)到50 mL,離心3 000 g,持續(xù)15 min,取上清液;加入PBS液1~3 mL,中和PH,直至達(dá)6.8;標(biāo)本處理后,接種到培養(yǎng)管實施液體培養(yǎng)。

        1.2.4 藥敏試驗 液體快速培養(yǎng)法分離的陽性菌株,根據(jù)《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[8]15-28,通過微孔板比例法,分別與一線藥物利福平、異煙肼進(jìn)行藥敏試驗。

        1.2.5 基因芯片法 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測試劑盒說明書提取痰樣DNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增、雜交、芯片處理及結(jié)果評估等。步驟:①取痰樣DNA:取1 mL痰樣,加入等量4% NaOH液化,13 000 r/min離心,持續(xù)5 min,棄上清液,取沉淀;以1 mL M洗液加入沉淀,混勻,10 000 r/min離心,持續(xù)2 min,棄上清液;以50 μL,裂解液加入沉淀,混勻,沸水處理10 min,10 000 r/min離心,持續(xù)2 min,取上清液。②PCR擴(kuò)增:取標(biāo)記好的PCR反應(yīng)管,5 000 rpm離心,持續(xù)2 s,加入4 μL已提取待測樣品DNA。取兩個PCR反應(yīng)管,分別加入M陰性、陽性質(zhì)控品DNA。擴(kuò)增條件:50℃條件下持續(xù)2 min,95℃條件下持續(xù)10 min,95℃條件下持續(xù)45 s,共20 cycles循環(huán)數(shù);64℃條件下持續(xù)60 s,95℃條件下持續(xù)30 s,56℃條件下持續(xù)30 s,共30 cycles循環(huán)數(shù);68℃條件下持續(xù)45 s,68℃條件下持續(xù)5 min。③雜交:將標(biāo)有患者編號的膜條置入15 mL塑料離心管,加5~6 mL AT液、25 μg PCR產(chǎn)物,混勻;沸水加熱10 min;離心管置入分子雜交箱,59℃條件下持續(xù)1.5 h;取50 mL塑料管,以40 mL B液加入,在分子雜交箱中預(yù)熱,直至59 ℃。同步處理陰性與陽性質(zhì)控品。④洗膜:膜條取出,轉(zhuǎn)移到預(yù)熱至59℃的B液塑料管中,輕搖洗滌,持續(xù)15 min;根據(jù)2 000∶1比例處理AT液、POD,配置孵育液,持續(xù)30 min;棄POD液;室溫下AT液輕搖2次,15 min/次;室溫下,C液洗膜,持續(xù)2 min;配置顯色液,置入膜條,避光顯色,持續(xù)5~10 min,觀察結(jié)果。經(jīng)由檢測利福平、異煙肼位點突變情況分析其耐藥型。基因芯片探針可檢測利福平耐藥相關(guān)基因rpoB 6個位點突變(S531W、D516G、D516V、H526D、S531L、H526Y)及異煙肼耐藥相關(guān)基因katG 315位密碼子等。檢測耐藥基因為野生型,即為相應(yīng)藥物敏感;檢測耐藥基因為突變型,即為相應(yīng)藥物耐藥。

        1.3 觀察指標(biāo)

        ①以液體快速培養(yǎng)技術(shù)為金標(biāo)準(zhǔn),判斷基因芯片診斷結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。其中,敏感度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100.0%;特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100.0%;陽性預(yù)測值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100.0%;陰性預(yù)測值=真陰性/(真陰性+假陰性)×100.0%。②以藥敏試驗結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),判斷基因芯片診斷結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼的耐藥檢出情況。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

        以SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)資料?;颊咝詣e、特異度、敏感度等計數(shù)資料用2檢驗?;颊吣挲g等計量資料以表示,以t檢驗。不同方法檢測結(jié)果一致性采用Kappa檢驗,Kappa值<0.4為一致性較差,0.4≤Kappa值<0.75為一致性較好,Kappa值≥0.75為一致性較高。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

        2 結(jié)果

        2.1 基因芯片法與液體快速培養(yǎng)法檢測結(jié)核分枝桿菌結(jié)果

        以液體快速培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為81.67%(49/60)、95.00%(38/40)、96.08%(49/51)、77.55%(38/49)。Kappa檢驗顯示兩者一致性較高(Kappa值=0.77)。

        2.2 基因芯片法與液體快速培養(yǎng)法對結(jié)核分枝桿菌陽性檢出率對比

        基因芯片法、液體快速培養(yǎng)法檢測整體陽性率分別為50.00%(50/100)、58.00%(58/100),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(2=1.288,P=0.256)。

        2.3 基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性

        本組100例痰標(biāo)本經(jīng)液體快速培養(yǎng)技術(shù),結(jié)果顯示結(jié)核分枝桿菌菌株陽性58例,均實施藥敏試驗。以58例標(biāo)本藥敏試驗檢測利福平、異煙肼耐藥結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn),基因芯片法檢測利福平耐藥敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為77.78%、97.96%、87.50%、96.00%,Kappa檢驗顯示兩者一致性較高(Kappa值=0.79);基因芯片檢測異煙肼耐藥敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為80.00%、100.00%、100.00%、96.00%,Kappa檢驗顯示兩者一致性較高(Kappa值=0.82)。見表1。

        表1 基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性分析 (n,%)

        3 討論

        作為臨床上一種常見慢性感染性疾病,結(jié)核病主要由結(jié)核分枝桿菌感染造成,臨床特征為干酪樣壞死、肉芽組織增生,極易累及人體多個器官,其中最常見為肺組織[9]。結(jié)核病又被稱為“癆病”、“白色瘟疫”等,發(fā)病歷史悠久,且病死率高。直至人類發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌在結(jié)核病發(fā)生中的作用,才開始進(jìn)行有效結(jié)核病防治[10-11]。特別是近年來,隨著利福平、異煙肼抗結(jié)核化療藥物的應(yīng)用,結(jié)核病病情明顯得到控制。但受國內(nèi)人口數(shù)量增多、人口流動、人類免疫缺陷病毒感染等因素影響,結(jié)核病疫情仍然較為嚴(yán)重。特別是近年來,耐藥性結(jié)核病發(fā)病人數(shù)不斷增多,治療難度大,病死率高。故需深入分析結(jié)核分枝桿菌耐藥機(jī)制及特點,尋找快速、準(zhǔn)確的方法檢測結(jié)核分枝桿菌,以指導(dǎo)早期診斷和治療,合理控制疫情。

        當(dāng)前,臨床上檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的方法較多,包括DNA直接測序技術(shù)、聚合酶聯(lián)反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、基因芯片、培養(yǎng)法等。其中,DNA直接測序技術(shù)在某些結(jié)核分枝桿菌耐藥性基因突變診斷中有重要作用,但也具有價格昂貴等弊端[12]。聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析無需特殊儀器、試劑,技術(shù)條件較為成熟,且不會導(dǎo)致出現(xiàn)放射性污染,檢測陽性率高[13]。但檢測過程中也極易受檢測DNA片段長度、膠濃度、緩沖液力度強(qiáng)度、電泳溫度等因素影響,且僅適用于篩選基因突變,應(yīng)用受限。液體培養(yǎng)法加藥敏試驗是結(jié)核病診斷金標(biāo)準(zhǔn),但也具有耗時時間長、程序繁瑣、重復(fù)性差等弊端,往往需要4~8周才能獲得檢測結(jié)果,影響結(jié)核病,特別是耐藥結(jié)核病的早期診斷和治療[14]。近年來,人們開始越來越多地關(guān)注基因芯片法在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用,該方法是在玻璃等固相載體上,以高密度方式固定生物信息分子,將待測樣本的DNA或RNA與探針雜交,通過特定儀器顯色及掃描,量化分析雜交結(jié)果,從而獲得檢測信息[15-17]。在分子突變檢測中,基因芯片技術(shù)不僅能對突變位點、突變類型進(jìn)行明確,還能同時檢測多個基因甚至整個基因組的突變,且具有特異度高等特點。近年來,隨著臨床上對結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)基因及突變位點研究的不斷深入,結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測中基因芯片技術(shù)的應(yīng)用開始引起人們的高度關(guān)注。陳蕾[18]調(diào)查發(fā)現(xiàn),結(jié)核病診斷中基因芯片法應(yīng)用價值較高,能快速檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥的常見突變位點,且能對非結(jié)核分枝桿菌屬進(jìn)行鑒別診斷。

        本次研究以液體快速培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn),判斷基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以液體快速培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)時,基因芯片檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為81.67%、95.00%、96.08%、77.55%,具有較高一致性。但本研究結(jié)果與董永康等[19]調(diào)查的敏感度92.3%、特異度100.00%存在偏差,考慮與標(biāo)準(zhǔn)選擇不同、標(biāo)本類型及質(zhì)量等因素有關(guān)。本次研究所選標(biāo)本類型均為痰液標(biāo)本,細(xì)菌數(shù)量可能較纖維支氣管鏡沖洗液低,故今后仍需加大研究力度,聯(lián)合應(yīng)用痰標(biāo)本和纖維支氣管鏡標(biāo)本進(jìn)行檢測。基因芯片法檢測結(jié)核分枝桿菌整體陽性率為50.00%,液體快速培養(yǎng)法則為58.00%,漏檢原因可能與實驗人員過早判讀菌落生長結(jié)果、受試菌株生長狀態(tài)等有關(guān)。此外,本次研究還重點分析了基因芯片法檢測利福平、異煙肼耐藥性。黃海濱等[20]調(diào)查發(fā)現(xiàn),基因芯片技術(shù)能有效檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼耐藥情況,且便于判斷katG、inhA、oxyR-ahpC以及rpoB基因突變位置。本次研究以藥敏試驗為標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)基因芯片法檢測利福平、異煙肼的耐藥敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為77.78%、97.96%、87.50%、96.00%和80.00%、100.00%、100.00%、96.00%,Kappa檢驗顯示一致性較高。陳林等[21]調(diào)查分析了結(jié)核病耐多藥快速檢測中基因芯片技術(shù)的應(yīng)用效果,并對比羅氏培養(yǎng)法,發(fā)現(xiàn)基因芯片技術(shù)對異煙肼耐藥檢測靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為80.2%、95.9%、71.8%、97.4%,對利福平耐藥檢測靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為86.42%、97.5%、80.9%、98.3%。從中可以發(fā)現(xiàn),本次研究利福平耐藥敏感度、陽性預(yù)測值較陳林等人報道低,且異煙肼耐藥特異度、陽性預(yù)測值較其報道高。筆者認(rèn)為,這一差異可能與該研究痰涂陽肺結(jié)核增加耐藥表型敏感度等因素有關(guān)??傮w來說,基因芯片對利福平、異煙肼耐藥檢測的敏感度和特異度均較高,與藥敏試驗一致性較高,提示其具有良好應(yīng)用價值。

        綜上所述,基因芯片法在結(jié)核病結(jié)核分枝桿菌檢測及耐藥性診斷中具有較高應(yīng)用價值,需引起高度關(guān)注。

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