艾尼瓦爾·艾木都拉 張瑞麗 楊 穎 包永星

腎細(xì)胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)是泌尿系常見的惡性腫瘤，國外的流行病學(xué)資料顯示，腎癌的發(fā)病率和死亡率近年來有逐漸増加的趨勢[1]。在我國腎癌的發(fā)病率居第二位，僅次于膀胱癌，好發(fā)年齡為50～70歲，其中男女比約為2∶1[2]。工程院院士郝希山領(lǐng)銜課題組對在中國59個惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，研究結(jié)果顯示納入研究的常見惡性腫瘤中，近20年來腎癌的發(fā)病率上升速度最快[3]。

腎癌起病隱匿，所以不容易早期發(fā)現(xiàn)，臨床發(fā)現(xiàn)時約有20%～30%的患者己有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即使早期發(fā)現(xiàn)的腎癌，通過手術(shù)治療后，仍有20%～40%的患者會出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。中晚期腎癌的治療效果差，而且目前尚缺乏有效的治療手段。研究腎癌預(yù)后因素對提高患者生存率、指導(dǎo)臨床實(shí)踐有著重要的意義。

核受體(Nuclear Receptor，NR)是與進(jìn)化有關(guān)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一。它與相應(yīng)的配體結(jié)合或信號激活后，通過在信號分子與轉(zhuǎn)錄應(yīng)答間建立聯(lián)系，調(diào)節(jié)不同靶基因的啟動子、配體或細(xì)胞類型特異性的表達(dá)，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。迄今為止，一共有48個核受體被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)近期研究，NR操控基因表達(dá)來調(diào)整細(xì)胞許多功能，尤其在腫瘤發(fā)生、增殖擴(kuò)散、進(jìn)展和預(yù)后方面起著重要作用。許多核受體被證實(shí)跟癌癥預(yù)后有明顯的關(guān)系。包括卵巢癌等[5]乳腺癌[6]，胃癌[4]，結(jié)腸癌[7]，前列腺癌[8]。但是核受體在腎透明細(xì)胞癌當(dāng)中潛在的作用及其在腫瘤發(fā)生，復(fù)發(fā)和預(yù)后方面的生物學(xué)功能有許多未知之處，可能是潛在的光譜人類腫瘤標(biāo)志物。此項(xiàng)研究的目的是核受體基因表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌預(yù)后之間的關(guān)系，找出新的Biomarker。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所統(tǒng)計(jì)腎癌資料為TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫內(nèi)的具有完整隨訪資料的509例腎透明細(xì)胞癌患者的臨床資料及相應(yīng)核受體mRNA表達(dá)水平信息。數(shù)據(jù)獲取后，首先將RNA標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)文件按照METADATA文件中提供的信息進(jìn)行重新命名，以便與RNA數(shù)據(jù)文件和臨床信息進(jìn)行比對。經(jīng)過比對，共有509例腎透明細(xì)胞癌患者的組織，所含RNA表達(dá)數(shù)據(jù)及臨床信息完整，納入了后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。包含的臨床指標(biāo)有患者年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、腫瘤分級；48種核受體的mRNA表達(dá)水平依據(jù)TCGA的標(biāo)準(zhǔn)化方法程序進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 統(tǒng)計(jì)分析方法

509例腎透明細(xì)胞癌患者的臨床資料及48種核受體基因表達(dá)水平資料取自TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫，生存率使用SPSS 17.0的Kaplan-Meier方法進(jìn)行計(jì)算，采用Log-rank檢驗(yàn)后分析出其單因素的影響因素，然后使用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行進(jìn)一步的生存率分析。在統(tǒng)計(jì)分析過程中，所有P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

509例腎透明細(xì)胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)(包括年齡、性別、患側(cè)、腫瘤大小、病理分級和臨床分期)見表1。

2.2 透明細(xì)胞腎癌患者的臨床特征及核受體的表達(dá)與患者預(yù)后之間的關(guān)系

為了解腎癌患者的臨床特征及核受體的表達(dá)與患者的預(yù)后之間的關(guān)系，隨后我們對臨床特征和基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(表1～4)。臨床特征單因素和多因素發(fā)現(xiàn)，患者年齡、分級、腫瘤大小、腫瘤分期等因素影響生存結(jié)局。48個核受體的表達(dá)水平與生存之間單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)其中一共有20個核受體的表達(dá)影響患者生存結(jié)局，基因表達(dá)在生存率方面存顯著性差異(P<0.05)。作為預(yù)后因素的臨床特征和核受體進(jìn)行Cox風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)后因素分析，發(fā)現(xiàn)年齡、大小、N分期、腫瘤分期以及AR、NR0B1、NR1D2、NR1I2、NR3C2、NR5A1、NR6A1、PPARα、THRB等核受體表達(dá)與生存之間存在顯著性差異(P<0.05)。作為獨(dú)立預(yù)后因素的核受體Kaplan-Meier法進(jìn)行生存率分析，生存曲線顯示AR(圖1)、NR5A1(圖2)、NR3C2(圖3)、NR6A1(圖4)、NR0B1(圖5)、THRB(圖6)、PPARα(圖7)等核受體低表達(dá)腎癌患者生存較高表達(dá)患者延長，作為良好的預(yù)后因素。NR1D2(圖8)、NR1I2(圖9)高表達(dá)患者生存較低表達(dá)患者延長，但生存曲線差異不明顯。

表1 509例腎透明細(xì)胞癌患者臨床病例特征

表2 單因素和多因素分析臨床特征情況對生存結(jié)存結(jié)局的影響

3 討論

腎癌起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)，是一種放、化療抵抗的腫瘤。腎癌起病隱匿，出現(xiàn)腎癌特異性臨床癥狀,患者早已是晚期，已出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。晚期轉(zhuǎn)移者患者治療效果僅為12%[9]。早期發(fā)現(xiàn)有助于提高患者的生存質(zhì)量，延長了患者的生存時間。因此，鑒定早期診斷標(biāo)志物，更多的預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)對于腎癌具有非常重要的臨床治療指導(dǎo)作用。

核受體(Nuclear Receptor，NR)是細(xì)胞核內(nèi)的配體依賴型的轉(zhuǎn)錄因子超家族，目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)的主要有48種不同類型。小分子化合物配體靶向結(jié)合核受體的配體結(jié)合區(qū)，通過輔助調(diào)控因子的參與，信號通路的激活，激活或抑制作用改變核受體活性，從而達(dá)到調(diào)控下游的表達(dá)的目的，參與生物體的許多生理過程中， 很多疾病的發(fā)生與核受體的異常調(diào)控相關(guān)。近幾年來，隨著對核受體研究的深入，已有研究證實(shí)核受體的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用在腫瘤細(xì)胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移、耐藥的過程中發(fā)揮一定作用。但是基于核受體表達(dá)的腎癌預(yù)后因素分析報(bào)告甚少。為了進(jìn)一步豐富腎癌預(yù)后有關(guān)的生物標(biāo)記物，本研究基于在不同的ccRCC患者中48個核受體的表達(dá)水平，結(jié)合其臨床病理特征，統(tǒng)計(jì)分析了影響腎癌生存結(jié)局的有關(guān)核受體，為腎癌的早期診斷、精確治療、預(yù)后預(yù)測和評估治療效提供新的生物靶點(diǎn)。

表3 48個核受體基因表達(dá)量對生存結(jié)局的影響

表4 核受體mRNA表達(dá)水平以及臨床特征Cox回歸分析

圖1 不同AR mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖2 不同NR5A1 mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖3 不同NR3C2 mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖4 不同NR6A1 mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖5 不同NR0B1 mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

雄激素受體(Androgen Receptor，AR)為配體依賴性核激素受體超家族的一員，屬于類固醇激素受體，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，AR在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增值和生長方面發(fā)揮重要作用。目前研究主要集中在前列腺癌、卵巢癌、肝癌等。本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，AR低表達(dá)腎癌患者組預(yù)后明顯好于高表達(dá)患者組，生存延長，是核受體中腎癌獨(dú)立的預(yù)后因素之一。腎癌患者男女發(fā)病比率為1.6∶1，腎癌發(fā)病率的性別差異一定的程度上歸因于雄激素及雄激素受體在腎癌發(fā)生發(fā)展中起到的作用。最近一項(xiàng)研究顯示，AR表達(dá)30%的腎癌組織中[10]，通過HIF-2α/VEGF信號通路促進(jìn)腎癌細(xì)胞的進(jìn)展[11]。另一項(xiàng)研究進(jìn)一步證實(shí)，AR通過調(diào)控AKT→NF-κB→CXCL5信號通路來增加內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和募集，促進(jìn)腎癌的進(jìn)展[12]。本研究，AR不同的表達(dá)水平，分析生存率，高表達(dá)組患者的生存率較低表達(dá)組患者縮短，考慮AR激活可能促進(jìn)腎癌細(xì)胞分化，增殖和疾病進(jìn)展有關(guān)。

圖6 不同THRB mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖7 不同PPARα mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖9 不同NR1D2 mRNA表達(dá)水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

NR0B1：是核受體轉(zhuǎn)錄因子，因?yàn)闆]有明確的配體,被稱為“孤兒”核受體，在人類腎上腺和生殖發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。本研究分析發(fā)現(xiàn)，NR0B1在腎癌不同的表達(dá)水平與預(yù)后之間顯著性差異(P<0.05)。生存分析顯示，NR0B1低表達(dá)腎癌患者組的生存較高表達(dá)組延長，是腎癌獨(dú)立的預(yù)后因素。目前研究顯示NR0B1在性激素分泌和生殖腺發(fā)育方面發(fā)揮一定的作用，但是具體的生物學(xué)功能尚未明確。與腎癌的發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移方面的作用有待進(jìn)一步研究。

NR1D2：是一個蛋白編碼基因。此基因編碼了一個核激素受體家族的成員，特別是受體的NR1亞族。編碼蛋白作為轉(zhuǎn)錄抑制因子，可以在晝夜節(jié)律、碳水化合物和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用。在許多報(bào)道中顯示，晝夜節(jié)律的中斷與哺乳動物的腫瘤發(fā)生有關(guān)[13]。缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，功能包括哺乳動物體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)、能量代謝、新生血管形成、酸堿度、細(xì)胞存活，生長和遷移等，被認(rèn)為是腫瘤生長的有力促進(jìn)劑。缺氧反應(yīng)途徑和生理周期之間存在緊密的相互關(guān)系。在腎癌患者中發(fā)現(xiàn)了對生物鐘回路和對缺氧的反應(yīng)有關(guān)的基因的失控，影響了腫瘤的形成過程，也影響了疾病的進(jìn)展和結(jié)果。改變生物鐘有關(guān)的基因表達(dá)及缺氧反應(yīng)有關(guān)的通路，可以促進(jìn)腎癌的發(fā)生和進(jìn)展[14]。所以NR1D2與腎癌預(yù)后之間關(guān)系考慮可能它參與調(diào)控的生理周期的失調(diào)而引起的HIF1-a基因的改變而引起腎癌發(fā)生和進(jìn)展。具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

NR1I2：編碼蛋白基因，編碼蛋白是細(xì)胞色素P450基因CYP3A4的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)劑，結(jié)合CYP3A4的反應(yīng)元件，作為啟動子與9-CIS維甲酸受體RXR結(jié)形成二聚體。研究證實(shí)，乳腺癌[15]、結(jié)腸癌[16]、卵巢癌[17]和子宮內(nèi)膜癌[18]等許多腫瘤中PXR蛋白的表達(dá)比非腫瘤組織增加，PXR蛋白表達(dá)相關(guān)同路的調(diào)控與腫瘤細(xì)胞的凋亡、分化和轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。研究證實(shí)，PXR蛋白高表達(dá)或者活性增加被考慮是卵巢癌[20]和乳腺癌[21]的不良預(yù)后因素。另外幾項(xiàng)研究還證實(shí)，它的高表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌[22]和前列腺癌[23]良好的預(yù)后有關(guān)。

腎癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，多因素分析，NR1I2表達(dá)水平影響腎癌的生存率，低表達(dá)組的患者生存率明顯高于高表達(dá)組患者(P<0.05)。研究已發(fā)現(xiàn)[24]，NR1I2在腎癌組織中高表達(dá)，它主要調(diào)控細(xì)胞色素P450基因CYP3A家族的的轉(zhuǎn)錄。CYP3A基因的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)與晚期腎癌的舒尼替尼治療中，藥物毒性引起的劑量減少相關(guān)并影響靶向治療后的預(yù)后。所以，NR1I2表達(dá)對腎癌生存的影響，可能是通過對細(xì)胞色素P450基因CYP3A轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。

NR3C2：編碼鹽皮質(zhì)激素受體，它能在有限的靶細(xì)胞內(nèi)調(diào)控醛固酮，維持水和鹽的平衡。NR3C2蛋白作為一種配體結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，它與鹽皮質(zhì)激素受體的反應(yīng)元件結(jié)合來激活，轉(zhuǎn)錄目標(biāo)基因。本研究，針對數(shù)據(jù)庫生物學(xué)信息的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，NR3C2的高表達(dá)在腎癌不良預(yù)后有關(guān)，但是未進(jìn)一步分析早期和晚期組的具體的表達(dá)差異，結(jié)果有待進(jìn)一步細(xì)化研究和驗(yàn)證。

NR5A1：此基因編碼的蛋白質(zhì)是決定性別有關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，主要表達(dá)在腎上腺和性腺。在20世紀(jì)90年代早期，由Keith Parker(美國)和Ken-ichirou Morohashi(日本)第一次發(fā)現(xiàn)[25-26]。被編碼的蛋白質(zhì)將DNA作為一種單體結(jié)合。本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)現(xiàn)NR5A1的低表達(dá)與腎癌良好的預(yù)后有關(guān)，作為獨(dú)立預(yù)后因素，低表達(dá)組腎癌生存延長的原因考慮可能跟它的衰竭引起的抑制腎癌細(xì)胞的生長有關(guān)。

NR6A1：是核激素受體家族的成員，其基因編碼孤兒核受體。它的表達(dá)可能與神經(jīng)形成和生殖細(xì)胞發(fā)育有關(guān)。與NR6A1轉(zhuǎn)錄相關(guān)的疾病包括胚胎癌和畸胎瘤。NR6A1在腎癌組織中的高表達(dá)是不良的預(yù)后因素，可能是NR6A1轉(zhuǎn)錄與腫瘤干細(xì)胞生長，分化等途徑有關(guān)。

PPARα：氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferator-activated Receptors，PPARα)在細(xì)胞分化、發(fā)育以及新陳代謝(糖、脂、蛋白質(zhì))和高等生物的腫瘤發(fā)生中起關(guān)鍵性的作用。有報(bào)道顯示它在黑色素瘤[27]、惡性膠質(zhì)瘤[28]中發(fā)揮抑制作用。而肝癌[29]、乳腺癌[30]等腫瘤中導(dǎo)致腫瘤生長的進(jìn)展。前期研究證實(shí)，在高分級的腎癌組織中，PPARα的表達(dá)高于低分級組織，PPARα抑制劑可以減少腎癌細(xì)胞活性，并通過葡萄糖抑制協(xié)同發(fā)揮抑制作用[31]。本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示低表達(dá)組的預(yù)后好于高表達(dá)組。

甲狀腺激素受體B(Thyroid Hormone Receptor Beta，THRB)：它是甲狀腺激素的幾種受體之一，是蛋白編碼基因，三碘甲狀腺原氨酸為配體的核受體。甲狀腺受體(TR)是與配體相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞凋亡，是類固醇激素/類維生素酸核受體超級家族的成員。THRB等位基因功能喪失時會發(fā)還發(fā)生體細(xì)胞的突變或者過度甲基化[32]。在肝癌[33]、甲狀腺癌[34]、腎癌[35]中均報(bào)道THRB基因的突變。透明細(xì)胞腎癌中發(fā)現(xiàn)TRalpha 和TRbeta mRNAs的異常表達(dá)，暗示TRs可能參與ccRCC的癌變。甲狀腺激素受體基因的突變導(dǎo)致T3的結(jié)合活性的喪失或者損傷結(jié)合甲狀腺激素反應(yīng)元件(TREs)，因此可以推斷腎癌組織中TRs正常功能受損，加上異常表達(dá)的模型，突變的TREs可能導(dǎo)致腎癌的致癌作用[36]。作為腎癌獨(dú)立預(yù)后因素，本研究生存分析提示，THRB低表達(dá)腎癌患者組生存較高表達(dá)組延長。早期研究已證實(shí)，THRB基因的突變是腎癌的致癌因素。

總之上述結(jié)果純粹是生物學(xué)信息的統(tǒng)計(jì)分析而得出的，需要在ccRCC患者臨床標(biāo)本上進(jìn)一步驗(yàn)證。