艾尼瓦爾·艾木都拉 張瑞麗 楊 穎 包永星

腎細胞癌(Renal Cell Carcinoma，RCC)是泌尿系常見的惡性腫瘤，國外的流行病學資料顯示，腎癌的發(fā)病率和死亡率近年來有逐漸増加的趨勢[1]。在我國腎癌的發(fā)病率居第二位，僅次于膀胱癌，好發(fā)年齡為50～70歲，其中男女比約為2∶1[2]。工程院院士郝希山領銜課題組對在中國59個惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率數(shù)據(jù)進行分析，研究結果顯示納入研究的常見惡性腫瘤中，近20年來腎癌的發(fā)病率上升速度最快[3]。

腎癌起病隱匿，所以不容易早期發(fā)現(xiàn)，臨床發(fā)現(xiàn)時約有20%～30%的患者己有遠處轉移，即使早期發(fā)現(xiàn)的腎癌，通過手術治療后，仍有20%～40%的患者會出現(xiàn)遠處轉移[4]。中晚期腎癌的治療效果差，而且目前尚缺乏有效的治療手段。研究腎癌預后因素對提高患者生存率、指導臨床實踐有著重要的意義。

核受體(Nuclear Receptor，NR)是與進化有關的DNA結合轉錄因子超家族成員之一。它與相應的配體結合或信號激活后，通過在信號分子與轉錄應答間建立聯(lián)系，調(diào)節(jié)不同靶基因的啟動子、配體或細胞類型特異性的表達，發(fā)揮其轉錄調(diào)控作用。迄今為止，一共有48個核受體被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)近期研究，NR操控基因表達來調(diào)整細胞許多功能，尤其在腫瘤發(fā)生、增殖擴散、進展和預后方面起著重要作用。許多核受體被證實跟癌癥預后有明顯的關系。包括卵巢癌等[5]乳腺癌[6]，胃癌[4]，結腸癌[7]，前列腺癌[8]。但是核受體在腎透明細胞癌當中潛在的作用及其在腫瘤發(fā)生，復發(fā)和預后方面的生物學功能有許多未知之處，可能是潛在的光譜人類腫瘤標志物。此項研究的目的是核受體基因表達水平與腎透明細胞癌預后之間的關系，找出新的Biomarker。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所統(tǒng)計腎癌資料為TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫內(nèi)的具有完整隨訪資料的509例腎透明細胞癌患者的臨床資料及相應核受體mRNA表達水平信息。數(shù)據(jù)獲取后，首先將RNA標準化數(shù)據(jù)文件按照METADATA文件中提供的信息進行重新命名，以便與RNA數(shù)據(jù)文件和臨床信息進行比對。經(jīng)過比對，共有509例腎透明細胞癌患者的組織，所含RNA表達數(shù)據(jù)及臨床信息完整，納入了后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。包含的臨床指標有患者年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、腫瘤分級；48種核受體的mRNA表達水平依據(jù)TCGA的標準化方法程序進行標準化。

1.2 統(tǒng)計分析方法

509例腎透明細胞癌患者的臨床資料及48種核受體基因表達水平資料取自TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫，生存率使用SPSS 17.0的Kaplan-Meier方法進行計算，采用Log-rank檢驗后分析出其單因素的影響因素，然后使用Cox風險回歸模型進行進一步的生存率分析。在統(tǒng)計分析過程中，所有P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

509例腎透明細胞癌患者的臨床數(shù)據(jù)(包括年齡、性別、患側、腫瘤大小、病理分級和臨床分期)見表1。

2.2 透明細胞腎癌患者的臨床特征及核受體的表達與患者預后之間的關系

為了解腎癌患者的臨床特征及核受體的表達與患者的預后之間的關系，隨后我們對臨床特征和基因表達數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計學分析(表1～4)。臨床特征單因素和多因素發(fā)現(xiàn)，患者年齡、分級、腫瘤大小、腫瘤分期等因素影響生存結局。48個核受體的表達水平與生存之間單因素和多因素分析發(fā)現(xiàn)其中一共有20個核受體的表達影響患者生存結局，基因表達在生存率方面存顯著性差異(P<0.05)。作為預后因素的臨床特征和核受體進行Cox風險模型預后因素分析，發(fā)現(xiàn)年齡、大小、N分期、腫瘤分期以及AR、NR0B1、NR1D2、NR1I2、NR3C2、NR5A1、NR6A1、PPARα、THRB等核受體表達與生存之間存在顯著性差異(P<0.05)。作為獨立預后因素的核受體Kaplan-Meier法進行生存率分析，生存曲線顯示AR(圖1)、NR5A1(圖2)、NR3C2(圖3)、NR6A1(圖4)、NR0B1(圖5)、THRB(圖6)、PPARα(圖7)等核受體低表達腎癌患者生存較高表達患者延長，作為良好的預后因素。NR1D2(圖8)、NR1I2(圖9)高表達患者生存較低表達患者延長，但生存曲線差異不明顯。

表1 509例腎透明細胞癌患者臨床病例特征

表2 單因素和多因素分析臨床特征情況對生存結存結局的影響

3 討論

腎癌起源于腎實質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng)，是一種放、化療抵抗的腫瘤。腎癌起病隱匿，出現(xiàn)腎癌特異性臨床癥狀,患者早已是晚期，已出現(xiàn)遠處轉移。晚期轉移者患者治療效果僅為12%[9]。早期發(fā)現(xiàn)有助于提高患者的生存質(zhì)量，延長了患者的生存時間。因此，鑒定早期診斷標志物，更多的預后因素和治療靶點對于腎癌具有非常重要的臨床治療指導作用。

核受體(Nuclear Receptor，NR)是細胞核內(nèi)的配體依賴型的轉錄因子超家族，目前己經(jīng)發(fā)現(xiàn)的主要有48種不同類型。小分子化合物配體靶向結合核受體的配體結合區(qū)，通過輔助調(diào)控因子的參與，信號通路的激活，激活或抑制作用改變核受體活性，從而達到調(diào)控下游的表達的目的，參與生物體的許多生理過程中， 很多疾病的發(fā)生與核受體的異常調(diào)控相關。近幾年來，隨著對核受體研究的深入，已有研究證實核受體的基因轉錄調(diào)控作用在腫瘤細胞分化、增殖、轉移、耐藥的過程中發(fā)揮一定作用。但是基于核受體表達的腎癌預后因素分析報告甚少。為了進一步豐富腎癌預后有關的生物標記物，本研究基于在不同的ccRCC患者中48個核受體的表達水平，結合其臨床病理特征，統(tǒng)計分析了影響腎癌生存結局的有關核受體，為腎癌的早期診斷、精確治療、預后預測和評估治療效提供新的生物靶點。

表3 48個核受體基因表達量對生存結局的影響

表4 核受體mRNA表達水平以及臨床特征Cox回歸分析

圖1 不同AR mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖2 不同NR5A1 mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖3 不同NR3C2 mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖4 不同NR6A1 mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖5 不同NR0B1 mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

雄激素受體(Androgen Receptor，AR)為配體依賴性核激素受體超家族的一員，屬于類固醇激素受體，實驗研究證實，AR在促進腫瘤細胞的增值和生長方面發(fā)揮重要作用。目前研究主要集中在前列腺癌、卵巢癌、肝癌等。本研究統(tǒng)計結果顯示，AR低表達腎癌患者組預后明顯好于高表達患者組，生存延長，是核受體中腎癌獨立的預后因素之一。腎癌患者男女發(fā)病比率為1.6∶1，腎癌發(fā)病率的性別差異一定的程度上歸因于雄激素及雄激素受體在腎癌發(fā)生發(fā)展中起到的作用。最近一項研究顯示，AR表達30%的腎癌組織中[10]，通過HIF-2α/VEGF信號通路促進腎癌細胞的進展[11]。另一項研究進一步證實，AR通過調(diào)控AKT→NF-κB→CXCL5信號通路來增加內(nèi)皮細胞的增殖和募集，促進腎癌的進展[12]。本研究，AR不同的表達水平，分析生存率，高表達組患者的生存率較低表達組患者縮短，考慮AR激活可能促進腎癌細胞分化，增殖和疾病進展有關。

圖6 不同THRB mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖7 不同PPARα mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

圖9 不同NR1D2 mRNA表達水平的509例ccRCC 患者的生存曲線分析

NR0B1：是核受體轉錄因子，因為沒有明確的配體,被稱為“孤兒”核受體，在人類腎上腺和生殖發(fā)育中起著關鍵作用。本研究分析發(fā)現(xiàn)，NR0B1在腎癌不同的表達水平與預后之間顯著性差異(P<0.05)。生存分析顯示，NR0B1低表達腎癌患者組的生存較高表達組延長，是腎癌獨立的預后因素。目前研究顯示NR0B1在性激素分泌和生殖腺發(fā)育方面發(fā)揮一定的作用，但是具體的生物學功能尚未明確。與腎癌的發(fā)生、進展、轉移方面的作用有待進一步研究。

NR1D2：是一個蛋白編碼基因。此基因編碼了一個核激素受體家族的成員，特別是受體的NR1亞族。編碼蛋白作為轉錄抑制因子，可以在晝夜節(jié)律、碳水化合物和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮作用。在許多報道中顯示，晝夜節(jié)律的中斷與哺乳動物的腫瘤發(fā)生有關[13]。缺氧誘導轉錄因子是基因轉錄調(diào)控因子，功能包括哺乳動物體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)、能量代謝、新生血管形成、酸堿度、細胞存活，生長和遷移等，被認為是腫瘤生長的有力促進劑。缺氧反應途徑和生理周期之間存在緊密的相互關系。在腎癌患者中發(fā)現(xiàn)了對生物鐘回路和對缺氧的反應有關的基因的失控，影響了腫瘤的形成過程，也影響了疾病的進展和結果。改變生物鐘有關的基因表達及缺氧反應有關的通路，可以促進腎癌的發(fā)生和進展[14]。所以NR1D2與腎癌預后之間關系考慮可能它參與調(diào)控的生理周期的失調(diào)而引起的HIF1-a基因的改變而引起腎癌發(fā)生和進展。具體的調(diào)控機制有待進一步研究。

NR1I2：編碼蛋白基因，編碼蛋白是細胞色素P450基因CYP3A4的轉錄調(diào)節(jié)劑，結合CYP3A4的反應元件，作為啟動子與9-CIS維甲酸受體RXR結形成二聚體。研究證實，乳腺癌[15]、結腸癌[16]、卵巢癌[17]和子宮內(nèi)膜癌[18]等許多腫瘤中PXR蛋白的表達比非腫瘤組織增加，PXR蛋白表達相關同路的調(diào)控與腫瘤細胞的凋亡、分化和轉移有關[19]。研究證實，PXR蛋白高表達或者活性增加被考慮是卵巢癌[20]和乳腺癌[21]的不良預后因素。另外幾項研究還證實，它的高表達與食管鱗狀細胞癌[22]和前列腺癌[23]良好的預后有關。

腎癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的結果。本研究結果顯示，多因素分析，NR1I2表達水平影響腎癌的生存率，低表達組的患者生存率明顯高于高表達組患者(P<0.05)。研究已發(fā)現(xiàn)[24]，NR1I2在腎癌組織中高表達，它主要調(diào)控細胞色素P450基因CYP3A家族的的轉錄。CYP3A基因的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)與晚期腎癌的舒尼替尼治療中，藥物毒性引起的劑量減少相關并影響靶向治療后的預后。所以，NR1I2表達對腎癌生存的影響，可能是通過對細胞色素P450基因CYP3A轉錄水平的調(diào)控來實現(xiàn)。

NR3C2：編碼鹽皮質(zhì)激素受體，它能在有限的靶細胞內(nèi)調(diào)控醛固酮，維持水和鹽的平衡。NR3C2蛋白作為一種配體結合的轉錄因子，它與鹽皮質(zhì)激素受體的反應元件結合來激活，轉錄目標基因。本研究，針對數(shù)據(jù)庫生物學信息的統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，NR3C2的高表達在腎癌不良預后有關，但是未進一步分析早期和晚期組的具體的表達差異，結果有待進一步細化研究和驗證。

NR5A1：此基因編碼的蛋白質(zhì)是決定性別有關的轉錄激活因子，主要表達在腎上腺和性腺。在20世紀90年代早期，由Keith Parker(美國)和Ken-ichirou Morohashi(日本)第一次發(fā)現(xiàn)[25-26]。被編碼的蛋白質(zhì)將DNA作為一種單體結合。本研究統(tǒng)計學發(fā)現(xiàn)NR5A1的低表達與腎癌良好的預后有關，作為獨立預后因素，低表達組腎癌生存延長的原因考慮可能跟它的衰竭引起的抑制腎癌細胞的生長有關。

NR6A1：是核激素受體家族的成員，其基因編碼孤兒核受體。它的表達可能與神經(jīng)形成和生殖細胞發(fā)育有關。與NR6A1轉錄相關的疾病包括胚胎癌和畸胎瘤。NR6A1在腎癌組織中的高表達是不良的預后因素，可能是NR6A1轉錄與腫瘤干細胞生長，分化等途徑有關。

PPARα：氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome Proliferator-activated Receptors，PPARα)在細胞分化、發(fā)育以及新陳代謝(糖、脂、蛋白質(zhì))和高等生物的腫瘤發(fā)生中起關鍵性的作用。有報道顯示它在黑色素瘤[27]、惡性膠質(zhì)瘤[28]中發(fā)揮抑制作用。而肝癌[29]、乳腺癌[30]等腫瘤中導致腫瘤生長的進展。前期研究證實，在高分級的腎癌組織中，PPARα的表達高于低分級組織，PPARα抑制劑可以減少腎癌細胞活性，并通過葡萄糖抑制協(xié)同發(fā)揮抑制作用[31]。本研究統(tǒng)計結果也顯示低表達組的預后好于高表達組。

甲狀腺激素受體B(Thyroid Hormone Receptor Beta，THRB)：它是甲狀腺激素的幾種受體之一，是蛋白編碼基因，三碘甲狀腺原氨酸為配體的核受體。甲狀腺受體(TR)是與配體相關的轉錄因子，調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和細胞凋亡，是類固醇激素/類維生素酸核受體超級家族的成員。THRB等位基因功能喪失時會發(fā)還發(fā)生體細胞的突變或者過度甲基化[32]。在肝癌[33]、甲狀腺癌[34]、腎癌[35]中均報道THRB基因的突變。透明細胞腎癌中發(fā)現(xiàn)TRalpha 和TRbeta mRNAs的異常表達，暗示TRs可能參與ccRCC的癌變。甲狀腺激素受體基因的突變導致T3的結合活性的喪失或者損傷結合甲狀腺激素反應元件(TREs)，因此可以推斷腎癌組織中TRs正常功能受損，加上異常表達的模型，突變的TREs可能導致腎癌的致癌作用[36]。作為腎癌獨立預后因素，本研究生存分析提示，THRB低表達腎癌患者組生存較高表達組延長。早期研究已證實，THRB基因的突變是腎癌的致癌因素。

總之上述結果純粹是生物學信息的統(tǒng)計分析而得出的，需要在ccRCC患者臨床標本上進一步驗證。