李 翠，周志云，楊 靜，楊曉莉

(陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，西安 710065)

本文按照國家標(biāo)準(zhǔn)[1-7]根據(jù)阪崎腸桿菌在分離平板的菌落形態(tài)，選擇不同生產(chǎn)單位的分離培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，對市售的不同生產(chǎn)單位的阪崎顯色培養(yǎng)基(DFI)進(jìn)行對比，評判不同生產(chǎn)單位培養(yǎng)基的選擇性強(qiáng)弱，為生產(chǎn)企業(yè)及相關(guān)檢驗機(jī)構(gòu)對培養(yǎng)基供應(yīng)商的選擇提供依據(jù)，為食品標(biāo)準(zhǔn)中阪崎腸桿菌檢驗培養(yǎng)基的選用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1試驗用菌株 阪崎腸桿菌(ATCC 29544-3)，批號：20160613，購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2儀器材料 LRH-250F生化培養(yǎng)箱，重慶萬達(dá)實驗儀器廠生產(chǎn)；WP-600恒水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，重慶萬達(dá)實驗儀器廠生產(chǎn)；LRH-250F生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；CC型BagSystem樣品均質(zhì)器系統(tǒng)，法國interscience生產(chǎn)；全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)VITEK2 Compact 30，法國梅里埃有限公司生產(chǎn)；革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡 (VITEK 2 GN Test Kit )，美國Biomer teux inc生產(chǎn)。

1.1.3培養(yǎng)基 試驗中使用的培養(yǎng)基信息見表1。

1.1.4樣品 奶粉，2017年國家食藥總局盲樣考核，規(guī)格100g/袋，樣品編號CODE1～CODE10；菌株，國家食藥總局盲樣考核，規(guī)格1株/支，樣品編號CODE1～CODE10。

表1 試驗中使用的培養(yǎng)基信息

注：編號A、B、C、D、E分別為不同生產(chǎn)單位的不同品牌的阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1前增菌和增菌 取奶粉100g和菌株1支從CODE1～CODE10分別加入已預(yù)熱至44℃裝有900mL緩沖蛋白胨水的均質(zhì)袋中，用均質(zhì)器均質(zhì)1min，使樣品充分溶解，置36℃培養(yǎng)18h。分別移取上述增菌液1mL轉(zhuǎn)種于10mL mLST-Vm肉湯，置44℃培養(yǎng)24h。

1.2.2分離 輕輕混勻mLST-Vm肉湯培養(yǎng)物，各取增菌培養(yǎng)物1環(huán)，分別劃線接種于5個生產(chǎn)單位各2個阪崎腸桿菌顯色培養(yǎng)基平板，36℃培養(yǎng)24h。從每個阪崎顯色培養(yǎng)基平板上分別挑取5個可疑菌落，不足5個的全部挑取，劃線接種于TSA平板，25℃培養(yǎng)48h。 自TSA平板上直接挑取黃色可疑菌落，進(jìn)行生化鑒定，并用VITEK 2全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

與其他腸桿菌不同，阪崎腸桿菌獨(dú)有a-葡萄糖苷酸酶。阪崎腸桿菌顯色瓊脂含有a-葡萄糖苷酸酶底物，當(dāng)被阪崎腸桿菌水解時形成藍(lán)綠色的陽性菌落。陽性菌株在所有生產(chǎn)單位生產(chǎn)的DFI上均顯示為藍(lán)綠色菌落。上述10個樣本在A單位的DFI平板上，CODE2、CODE7有藍(lán)綠色菌落生長，其余8個樣本在DFI平板上均為褐色菌落；在B單位的DFI平板上除CODE5無菌落生長外，其余9個樣本在DFI平板上均有藍(lán)綠色菌落生長；在C單位的DFI平板上CODE2、CODE6、CODE7有藍(lán)綠色菌落生長，CODE5無菌落生長，其余樣本為白色菌落、白色中心黑色菌落；在D單位的DFI平板上，CODE2、CODE3、CODE4、CODE6、CODE7、CODE8、CODE10有藍(lán)綠色菌落生長，CODE5和CODE9均為淺紫色菌落；在E單位的DFI平板上，CODE2、CODE7有藍(lán)綠色菌落生長，其余8個樣本在DFI平板上均為褐色菌落(表2)。

表3顯示，對A單位DFI平板上的藍(lán)綠色菌落進(jìn)行鑒定，從CODE2平板上挑取的5個菌落和從CODE7平板上挑取的5個菌落均確認(rèn)為阪崎腸桿菌。對B單位DFI平板上的藍(lán)綠色菌落進(jìn)行鑒定，CODE2平板上挑取的5個菌落中有3個確認(rèn)為阪崎腸桿菌，其余2個菌落確認(rèn)為奇異變形桿菌；CODE7平板上挑取的5個菌落中有3個確認(rèn)有阪崎腸桿菌，其余2個菌落確認(rèn)為奇異變形桿菌，CODE1、CODE3、CODE4、CODE8、CODE9、CODE10上分別挑取的5個菌落均確認(rèn)為奇異變形桿菌，CODE6上挑取的5個菌落均確認(rèn)為弗勞地檸檬酸桿菌。對C單位DFI平板上的藍(lán)綠色菌落進(jìn)行鑒定，CODE2和CODE7平板上挑取的5個菌落均確認(rèn)為阪崎腸桿菌，CODE6上挑取的5個菌落均確認(rèn)為弗勞地檸檬酸桿菌。對D單位DFI平板上的藍(lán)綠色菌落進(jìn)行鑒定，CODE2上挑取的5個菌落均確認(rèn)為阪崎腸桿菌；CODE7上挑取的5個菌落中有2個菌落確認(rèn)為阪崎腸桿菌，其余3個確認(rèn)為奇異變形桿菌；CODE1、CODE3、CODE4、CODE8、CODE10上分別挑取的5個菌落均確認(rèn)為奇異變形桿菌，CODE6上挑取的5個菌落均確認(rèn)為弗勞地檸檬酸桿菌。對E單位DFI平板上的藍(lán)綠色菌落進(jìn)行鑒定，從CODE2平板上挑取的5個菌落和從CODE7平板上挑取的5個菌落均確認(rèn)為阪崎腸桿菌。

表2 樣品在DFI平板上的菌落形態(tài)

(續(xù))

表3 各疑似菌落VITEK 2鑒定結(jié)果

備注：“/”表示顯色平板未見疑似，未進(jìn)行確認(rèn)試驗；“+”表示檢出阪崎腸桿菌；“-”表示未檢出阪崎腸桿菌

表4顯示，A和E單位的DFI選擇性明顯優(yōu)于其他3個單位的顯色培養(yǎng)基，10份樣本中有2個樣本在顯色培養(yǎng)基上有疑似菌落生長，從2個樣本中挑取10個疑似菌落經(jīng)純化、鑒定確證為阪崎腸桿菌，陽性準(zhǔn)確率達(dá)到100%，假陽性菌落數(shù)為0；C單位的DFI選擇性次之，10個樣本中有3個樣本在顯色培養(yǎng)基上有疑似菌落生長，從3個樣本中挑取15個疑似菌落經(jīng)純化、鑒定確證10個疑似菌落為阪崎腸桿菌，陽性準(zhǔn)確率為66.67%，假陽性菌落數(shù)為5；D單位的DFI和B單位的DFI選擇性最低，10份樣本中分別有7個樣本和9個樣本在顯色培養(yǎng)基上有疑似菌落生長，分別挑取35個疑似菌落和45個疑似菌落經(jīng)純化、鑒定確證為阪崎腸桿菌的菌落數(shù)分別為7和6，假陽性菌落數(shù)分別為22和39，準(zhǔn)確率僅為20.00%和13.33%。

表4 各生產(chǎn)單位顯色培養(yǎng)基選擇性對比結(jié)果

3 討論

本實驗中E單位和A單位生產(chǎn)的DFI培養(yǎng)基具有較好的選擇性，準(zhǔn)確率均達(dá)到100%，且在平板上生長的菌落形態(tài)比較典型，在阪崎腸桿菌檢查時，可首選此2個生產(chǎn)單位的顯色培養(yǎng)基進(jìn)行實驗。顯色培養(yǎng)基也存在一定的缺陷，由于某些腸道細(xì)菌也會含有與阪崎腸桿菌相同的α-D-葡萄糖苷酶，或奶粉在生產(chǎn)加工的過程中添加的有機(jī)或無機(jī)成分種類多且復(fù)雜，影響了酶與底物的反應(yīng)，在沒有高效的前增菌條件下，會出現(xiàn)假陽性和假陰性現(xiàn)象，從而干擾目標(biāo)菌的檢測。這些缺陷可以通過改變增菌培養(yǎng)條件等方法彌補(bǔ)而取得良好的分離、鑒定效果[8]。進(jìn)行阪崎腸桿菌的檢查時，在樣品的前增菌和增菌培養(yǎng)中要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作，樣品要加入到預(yù)熱至44℃的緩沖蛋白胨水充分溶解，轉(zhuǎn)種的mLST-Vm肉湯要臨用新制，保證在24h內(nèi)使用，使樣品中可能污染的微生物充分復(fù)蘇，以得到更加科學(xué)、準(zhǔn)確地實驗結(jié)果，確保食品的安全、可靠。B單位和D單位生產(chǎn)的DFI培養(yǎng)基選擇性低，假陽性樣本數(shù)分別為5和7，準(zhǔn)確率分別為13.33%、20.00%，假陽性樣本數(shù)較多，在顯色培養(yǎng)基分離中不能快速、有效、準(zhǔn)確的篩選出目標(biāo)菌，使整個實驗變得復(fù)雜，增加工作量。對于沒有生化鑒定系統(tǒng)，需要通過顯色培養(yǎng)基篩選結(jié)果判定的單位，可能會造成誤判。建議必須通過API、VITEK、PCR等鑒定后才可以下結(jié)論。對同種培養(yǎng)基不同生產(chǎn)單位的對比較少[9-13]，而不同生產(chǎn)單位的同種培養(yǎng)基的選擇性、準(zhǔn)確率差異較大，因此，建議各單位在參加盲樣考核、能力驗證、比對試驗時盡量選擇不同生產(chǎn)單位的增菌培養(yǎng)基或選擇性分離培養(yǎng)基，避免因培養(yǎng)基的質(zhì)量差異而出現(xiàn)檢驗結(jié)果的錯判。同時，嚴(yán)格按照國標(biāo)[14]進(jìn)行培養(yǎng)基的驗收檢查?！?/p>