管 敏，張厚本，王 龍，唐大明，張德志，姜 偉

(中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所，三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443100)

史氏鱘 (Acipenserschrenckii) 俗稱七粒浮子，主要分布于黑龍江、烏蘇里江和松花江等地，因其生長(zhǎng)速度快、抗逆性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，逐漸發(fā)展成為我國(guó)鱘養(yǎng)殖的主要品種之一[1]。史氏鱘作為一種亞冷水性魚類，環(huán)境溫度是影響其正常生長(zhǎng)和代謝的重要環(huán)境因子之一，其最適生長(zhǎng)水溫為19～22 ℃[2]。在史氏鱘的養(yǎng)殖過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)因季節(jié)更替、氣候變化及人為因素的原因?qū)е滤疁爻霈F(xiàn)節(jié)律性或突發(fā)性的溫度驟變[3]，從而對(duì)其造成一定程度的低溫脅迫。低溫脅迫包括冷馴化和溫度驟變，前者是指水溫的緩慢降低(慢性低溫脅迫)，而后者則指水溫的驟降(急性低溫脅迫)[4]。研究表明，低溫脅迫可以對(duì)魚類的行為[5]、營(yíng)養(yǎng)代謝[6]、血液指標(biāo)[5]、抗氧化能力[7]、免疫[8]、生殖進(jìn)程[9]、胚胎發(fā)育和仔魚發(fā)育[10]等產(chǎn)生影響。當(dāng)?shù)蜏孛{迫的強(qiáng)度在魚體耐受范圍內(nèi)時(shí)，魚體會(huì)通過(guò)自我調(diào)節(jié)適應(yīng)低溫環(huán)境;當(dāng)?shù)蜏孛{迫的強(qiáng)度超出魚類承受能力時(shí)，魚體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)將發(fā)生不可逆的改變，最終導(dǎo)致死亡[11]。因此，研究急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘抗氧化和免疫的影響，可為史氏鱘的人工養(yǎng)殖和運(yùn)輸提供重要的理論指導(dǎo)，具有非常重要的實(shí)際意義。

目前，關(guān)于史氏鱘的研究主要集中在營(yíng)養(yǎng)[12]、繁殖[1]、病害[13]等方面，而關(guān)于急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究急性低溫脅迫條件下史氏鱘幼魚抗氧化和免疫指標(biāo)的變化情況，掌握水溫驟降對(duì)其代謝水平和生理狀況的影響，從而為深入研究史氏鱘幼魚應(yīng)激反應(yīng)及耐寒機(jī)理提供理論依據(jù)，也為優(yōu)化史氏鱘的養(yǎng)殖、運(yùn)輸技術(shù)提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚為中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所2016年全人工繁殖所得的史氏鱘幼魚。隨機(jī)挑選規(guī)格一致、體質(zhì)健康史氏鱘幼魚162尾，體質(zhì)量為 (180±16)g，體長(zhǎng)為(30.50±1.50)cm，并將其暫養(yǎng)于直徑4.0 m的養(yǎng)殖池中，暫養(yǎng)水溫為23 ℃，溶氧6.0～7.0 mg/L，pH 7.3～7.6，氨氮0.01 mg/L，亞硝氮為0.005 mg/L，每天飽食投喂1次，3 d后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)開始前1 d停止投喂。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)在直徑4.0 m、水深0.8 m的實(shí)驗(yàn)池中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)水溫設(shè)置3個(gè)溫度水平，分別為23、17和11 ℃，其中，23 ℃組為常溫對(duì)照組，每個(gè)溫度組設(shè)3個(gè)平行組，每個(gè)平行組18尾魚。具體方法為:使用循環(huán)水系統(tǒng)的制冷機(jī)將實(shí)驗(yàn)池中的水溫由23.0 ℃降至設(shè)定溫度后，將實(shí)驗(yàn)魚從水溫23℃的暫養(yǎng)池中分別直接轉(zhuǎn)至水溫為11、17和23 ℃的實(shí)驗(yàn)池中，2 h后再轉(zhuǎn)回水溫23 ℃的暫養(yǎng)池中進(jìn)行恢復(fù)，并于0、3、6、12、24、48 h時(shí)取樣，每個(gè)溫度組每次取樣9尾魚;23 ℃組作為對(duì)照組，雖然水溫沒有變化，但也要經(jīng)歷人為轉(zhuǎn)魚的操作過(guò)程，避免人工操作對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的誤差。實(shí)驗(yàn)期間，連續(xù)充氣，每隔30 min校準(zhǔn)調(diào)節(jié)一次溫度，維持溫差在±0.5 ℃。

1.3 樣品的采集處理及各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定

用120 mg/L的MS-222將實(shí)驗(yàn)魚快速麻醉后解剖，取肝臟組織。用預(yù)冷的魚用生理鹽水將肝臟沖洗干凈，濾紙吸干水分后將其切成小塊，并置于2 mL離心管中，經(jīng)液氮快速冷凍后，置于-70 ℃保存待測(cè)。

抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽(GSH)含量、丙二醛(MDA)含量、總抗氧化能力(T-AOC)活性;免疫指標(biāo)包括溶菌酶(LZM)活性和免疫球蛋白M(IgM)。以上指標(biāo)的測(cè)定采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒，具體實(shí)驗(yàn)方法參考其說(shuō)明書。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS16.0和Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，利用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)低溫脅迫對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)影響的顯著性，差異的顯著性以P< 0.05為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 急性低溫脅迫條件下史氏鱘幼魚的行為表現(xiàn)

當(dāng)水溫由23 ℃驟降至17 ℃時(shí)，史氏鱘幼魚的應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，呼吸頻率加快，四處亂竄，不斷撞擊池壁，10 min后游動(dòng)逐漸變慢，30 min后大部分魚伏底不動(dòng);當(dāng)水溫由23 ℃驟降至11 ℃時(shí)，史氏鱘幼魚應(yīng)激反應(yīng)更為強(qiáng)烈，甚至有魚跳出水面的現(xiàn)象，隨著時(shí)間的推移，魚體游動(dòng)的速度迅速下降，15 min后伏底不動(dòng)，低溫脅迫結(jié)束時(shí)，魚體吻端、腹部和肛門充血，但未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

2.2 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 SOD活性

如圖1所示，17 ℃和11 ℃組SOD活性隨恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)均呈波浪式變化，但11 ℃組SOD活性趨勢(shì)變化的時(shí)間拐點(diǎn)明顯滯后于17 ℃組;在23 ℃組中，SOD活性隨著恢復(fù)時(shí)間的增加總體呈緩慢增加的趨勢(shì)，其中，0 h組與48 h組差異顯著。此外，在0 ～3 h時(shí)，SOD活性隨水溫驟降溫差的增大呈先升后降的趨勢(shì)，且17 ℃組與11 ℃、23 ℃組差異顯著。

圖1 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚SOD活性的影響Fig.1 Effect of acute temperature stress on the SOD activity of juvenile Amur sturgeon圖柱上方不同小寫字母表示同一時(shí)間段內(nèi)不同溫度組之間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一溫度組不同恢復(fù)時(shí)間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2.2 CAT活性

圖2顯示，各溫度組CAT活性的變化趨勢(shì)與SOD相似。在11 ℃組中，6 h的CAT活性最大，顯著高于3 h組和24 h組;17 ℃組中，CAT活性在24 h時(shí)達(dá)到最大值，且24 h組與0 h組、3 h組均差異顯著;23 ℃組中，0 h組、3 h組CAT活性均顯著低于24 h組和48 h組。此外，17 ℃組CAT活性在各個(gè)時(shí)間段均高于11 ℃組和23 ℃組，但在0～12 h中差異均不顯著。

圖2 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚CAT活性的影響Fig.2 Effect of acute temperature stress on the CAT activity of juvenile Amur sturgeon

2.2.3 GSH含量

結(jié)果顯示，各溫度組GSH含量隨恢復(fù)時(shí)間的增加均呈波浪式變化(圖3)。在17 ℃組中，GSH含量先下降后升高，于24 h達(dá)到最大值，隨后又顯著下降;23 ℃組GSH含量的變化趨勢(shì)與17 ℃組相同，但各時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著;11 ℃組中，GSH含量在0～12 h顯著增加，24 h時(shí)出現(xiàn)顯著下降，隨后升高。結(jié)果還顯示，在0 h時(shí)，11 ℃組GSH含量顯著低于17 ℃、23 ℃組；而在6 h時(shí)，11 ℃組顯著高于17 ℃、23 ℃組;其它時(shí)間段內(nèi)，各組之間差異不顯著。

圖3 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚GSH含量的影響Fig.3 Effect of acute temperature stress on the GSH content of juvenile Amur sturgeon

2.2.4 T-AOC活性

如圖4所示，各溫度組T-AOC活性隨時(shí)間的增加基本均呈先升后降的趨勢(shì)。23 ℃組T-AOC活性在24 h時(shí)達(dá)到最大值，各時(shí)間組間差異不顯著;17 ℃組中，24 h T-AOC活性顯著高于其它各時(shí)間點(diǎn);11 ℃組中，T-AOC活性在12 h時(shí)達(dá)到最大值，顯著高于0、24和48 h。此外，11 ℃組T-AOC活性在3～48 h中顯著低于17 ℃組。

圖4 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚T-AOC活性的影響Fig.4 Effect of acute temperature stress on the T-AOC activity of juvenile Amur sturgeon

2.2.5 MDA含量

如圖5所示，17 ℃和11 ℃組MDA含量隨恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)均呈波浪式變化，其中，17 ℃組MDA含量趨勢(shì)變化的時(shí)間拐點(diǎn)為3、6和24 h，11 ℃組MDA含量趨勢(shì)變化的時(shí)間拐點(diǎn)明顯滯后于17 ℃組，分別為6 h和24 h;11 ℃組MDA含量在0、3和12 h均顯著高于17 ℃、23 ℃組;23 ℃組MDA含量在0～24 h呈緩慢增加的趨勢(shì)，48 h時(shí)出現(xiàn)顯著下降。

圖5 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚MDA含量的影響Fig.5 Effect of acute temperature stress on the MDA content of juvenile Amur sturgeon

2.3 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚免疫能力的影響

2.3.1 LZM活性

如圖6所示，23 ℃組LZM活性隨著恢復(fù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢增加的趨勢(shì)，48 h顯著高于0 h;17 ℃組LZM活性隨恢復(fù)時(shí)間增加呈波浪式變化，其趨勢(shì)變化的時(shí)間拐點(diǎn)為3、6和24 h;11 ℃組LZM活性隨恢復(fù)時(shí)間的變化趨勢(shì)與17 ℃組基本相同，但趨勢(shì)變化的時(shí)間拐點(diǎn)(3 h和24 h)明顯滯后于17 ℃;此外，在0、3和6 h時(shí)，17 ℃時(shí)LZM活性均顯著高于11 ℃組。

圖6 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚LZM活性的影響Fig.6 Effect of acute temperature stress on the LZM activity of juvenile Amur sturgeon

2.3.2 IgM含量

在11、17 ℃組中，IgM含量隨恢復(fù)時(shí)間增加均呈先下降后升高的趨勢(shì)(圖7);在23 ℃組中，IgM含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢增加的趨勢(shì)。在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)，3個(gè)溫度組中IgM含量由大到小依次均為23 ℃組、17 ℃組和11 ℃組。

圖7 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚IgM含量的影響Fig.7 Effect of acute temperature stress on the IgM content of juvenile Amur sturgeon

3 討論

3.1 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚抗氧化指標(biāo)的影響

水溫與魚類的各項(xiàng)生理活動(dòng)有著非常緊密的關(guān)聯(lián)，溫度的變化會(huì)對(duì)魚類的行為、抗氧化防御系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等均會(huì)產(chǎn)生一定的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明水溫驟降不僅對(duì)史氏鱘幼魚的游泳、呼吸等行為均產(chǎn)生了一定程度的影響，還導(dǎo)致魚體個(gè)別部位發(fā)生充血現(xiàn)象，與田甜等[14]的研究結(jié)果相似，這說(shuō)明溫度突變對(duì)魚體產(chǎn)生了較強(qiáng)的脅迫作用，打破了魚體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，導(dǎo)致自由基 (ROS)大量產(chǎn)生，進(jìn)而對(duì)魚體造成一定程度的損傷[15]。

超氧化物歧化酶 (SOD) 和過(guò)氧化氫酶 (CAT) 是抗氧化防御體系中非常重要的功能酶[16]，可聯(lián)合清除ROS，其活性的下降標(biāo)志著機(jī)體清除ROS的能力下降[17]。本研究中，11 ℃組SOD和CAT活性隨時(shí)間的變化趨勢(shì)與17 ℃組基本相同，但其趨勢(shì)變化的時(shí)間拐點(diǎn)明顯滯后于17 ℃組。這說(shuō)明水溫驟降溫差越大，對(duì)史氏鱘SOD和CAT活性的影響越大，其恢復(fù)至正常狀態(tài)所需時(shí)間也更長(zhǎng)。23 ℃組SOD和CAT活性隨時(shí)間的變化總體呈緩慢增加的趨勢(shì)，可能與實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)魚停食3 d對(duì)魚體造成了一定程度的短期饑餓脅迫有關(guān)，這可能也是11 ℃組和17 ℃組SOD和CAT活性在24 h或48 h又出現(xiàn)升高的原因。另外，急性低溫脅迫后恢復(fù)0～3 h時(shí)，史氏鱘幼魚SOD、CAT活性隨水溫驟降溫差的增大均呈先升后降的趨勢(shì)，這與謝明媚等[18]、強(qiáng)俊等[19]的研究結(jié)果相同。表明當(dāng)水溫由23 ℃驟降至17 ℃時(shí)，魚體可以通過(guò)提高SOD和CAT活性來(lái)應(yīng)對(duì)低溫應(yīng)激反應(yīng)對(duì)魚體的影響;但當(dāng)水溫驟降溫差增至12 ℃時(shí)，魚體抗氧化酶活性受到顯著抑制，使得11 ℃組SOD活性顯著低于17 ℃組。

谷胱甘肽(GSH)是一種低分子自由基清除劑，是清除ROS非常重要的非酶抗氧化物質(zhì)[20]。本實(shí)驗(yàn)條件下，各溫度組GSH含量隨恢復(fù)時(shí)間的增加均呈波浪式變化，在12～24 h達(dá)到最大值后逐漸下降。這說(shuō)明，隨著機(jī)體恢復(fù)時(shí)間的增加，GSH消耗量逐漸減小;而12～24 h后，肝臟GSH含量受魚體短期饑餓的影響又出現(xiàn)波動(dòng)。這與劉松巖[21]研究饑餓脅迫對(duì)中華鱘血清GSH含量影響的結(jié)果基本一致。此外，在0 h時(shí)，11 ℃組GSH含量顯著低于17 ℃組和23 ℃組，這說(shuō)明驟降溫差越大，機(jī)體產(chǎn)生的ROS越多，GSH消耗量越大。這也與李大鵬等[22]研究水溫對(duì)中華鱘血清活性氧含量及抗氧化防御系統(tǒng)的影響時(shí)所得出的結(jié)論相同。

總抗氧化能力(T-AOC)的大小是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能的綜合性指標(biāo)，它可以反映機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外來(lái)脅迫的能力[23]。本研究中，低溫脅迫組T-AOC活性在0 h最低，隨著ROS不斷被清除，T-AOC活性開始不斷增加，這說(shuō)明魚體針對(duì)低溫脅迫已開啟自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)消耗抗氧化物質(zhì)來(lái)抵抗氧化反應(yīng)帶來(lái)的損傷;在12～24 h時(shí)，T-AOC活性出現(xiàn)下降，原因可能與短期饑餓脅迫對(duì)魚體的影響有關(guān)。此外，11 ℃組T-AOC活性在3～48 h均顯著低于17 ℃組，這說(shuō)明12 ℃驟降溫差對(duì)魚體的總抗氧化能力產(chǎn)生了顯著抑制作用，從而導(dǎo)致11 ℃組T-AOC活性恢復(fù)速度顯著低于17 ℃組。

丙二醛(MDA)是ROS與脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，它能夠加劇細(xì)胞膜的損傷，可以反映組織細(xì)胞受ROS攻擊的程度，從而間接反映機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[18]。結(jié)果表明，17 ℃組和11 ℃組MDA含量隨恢復(fù)時(shí)間增加呈波浪式變化，這是魚體抗氧化防御體系對(duì)抗應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。結(jié)果還表明，11 ℃組MDA含量在0、3、6、12和48 h均高于17 ℃組和23 ℃組，且11 ℃組MDA含量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)明顯滯后于17 ℃組。這說(shuō)明水溫驟降溫差越大，對(duì)肝臟損傷程度越大，其恢復(fù)至正常狀態(tài)所需的時(shí)間越長(zhǎng)。這與孫學(xué)亮等[24]的研究結(jié)果基本相同，但江東能等[25]研究表明以色列紅羅非魚(Oreochromissp.)血清中MDA含量隨脅迫溫度的降低而降低，原因可能是ROS的產(chǎn)生量隨魚體溫度的降低而下降。

3.2 急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚免疫指標(biāo)的影響

溶菌酶(LZM)是魚體非常重要的免疫因子，它可以破壞革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，從而瓦解細(xì)菌細(xì)胞[26]。Saurabh等[27]報(bào)道，魚體溶菌酶活性與水溫、鹽度、細(xì)菌等環(huán)境因子密切相關(guān)。石小濤[28]研究認(rèn)為擁擠脅迫會(huì)降低史氏鱘稚魚的LZM活性，何杰等[29]也曾報(bào)道，在急性應(yīng)激條件下，魚體血清中LZM活性會(huì)顯著增加，肝臟也會(huì)受到一定程度的損傷。本研究中，23 ℃組LZM活性受短期饑餓的影響出現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì);17 ℃組LZM活性在0、3和6 h時(shí)均顯著高于11 ℃組，這說(shuō)明12 ℃的水溫驟降幅度顯著降低了魚體溶菌酶活性，對(duì)機(jī)體的免疫功能產(chǎn)生了顯著的抑制作用。這與童燕[17]的研究結(jié)果類似，即隨著鹽度的增加，史氏鱘血清LZM活性先升后降。該結(jié)果也與Fevolden等[30]認(rèn)為脅迫的強(qiáng)度和方法可以影響溶菌酶活性變化的觀點(diǎn)一致。

免疫球蛋白M(IgM)是魚體內(nèi)一種重要的免疫球蛋白[29]，主要分布在血液中，是機(jī)體受抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體，具有強(qiáng)大的抗感染作用，因此，IgM含量的多少是評(píng)價(jià)魚體免疫應(yīng)答反應(yīng)的一項(xiàng)重要指標(biāo)[19]。本研究中，在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)，三個(gè)溫度組IgM含量由大到小依次為23 ℃組、17 ℃組和11 ℃組，表明溫度的驟降抑制了魚體IgM的產(chǎn)生，會(huì)對(duì)魚體的免疫功能產(chǎn)生顯著的抑制作用。這與低溫脅迫對(duì)銀鯧 (Pampusargenteus)幼魚[19]、羅非魚(Oreochromismossambicus)[29]的血清IgM影響結(jié)果基本類似，說(shuō)明溫度的驟降抑制了IgM的產(chǎn)生，降低了魚體的免疫力。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)急性低溫脅迫對(duì)史氏鱘幼魚抗氧化能力和免疫機(jī)能具有顯著的影響，隨著恢復(fù)時(shí)間的增加，魚體抗氧化能力和免疫機(jī)能不斷恢復(fù)，但11 ℃組的恢復(fù)速度要顯著慢于17 ℃組，說(shuō)明12 ℃的驟降溫差顯著抑制了魚體的抗氧化防御能力和免疫機(jī)能，對(duì)魚體的機(jī)能產(chǎn)生了顯著的不利影響，且修復(fù)較為緩慢。因此，在史氏鱘的實(shí)際養(yǎng)殖及運(yùn)輸過(guò)程中，應(yīng)密切關(guān)注水溫的變化，盡量避免水溫驟變脅迫對(duì)魚體造成損傷。