董 靖，劉永濤，胥 寧，宋 懌，鄢志紅，楊秋紅，楊移斌，艾曉輝

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢430223；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院,北京100039；3.荊州市天佳飼料有限公司，荊州434100)

水蛭(WhitmaniapigraWhitman)是傳統(tǒng)中藥，具有廣泛的藥理學(xué)活性，除了抗凝、抗血栓活性以外，近來年研究發(fā)現(xiàn)，水蛭還具有抗炎、抗腫瘤和抗纖維化等作用，在預(yù)防和治療多種疾病過程中均發(fā)揮了重要作用[1]。近年來水蛭作為藥材在國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥領(lǐng)域的需求量較大，但由于過度捕撈和環(huán)境污染等原因?qū)е乱吧钨Y源銳減，因此水蛭養(yǎng)殖成為近年來的新興養(yǎng)殖品種，具有廣闊的市場(chǎng)前景[2]。日本醫(yī)蛭是我國(guó)藥典收錄的水蛭品種，具有極強(qiáng)的抗凝血活性，是目前較為常見的養(yǎng)殖品種之一。隨著近年來水蛭養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度的不斷擴(kuò)大，其病害也時(shí)有發(fā)生，一旦發(fā)病給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)水蛭病害研究和防治鮮有報(bào)道，僅有部分國(guó)內(nèi)研究人員報(bào)道過菲牛蛭和寬體金錢蛭病原分離及中西藥物篩選，而日本醫(yī)蛭病原及其防治方法研究目前未見報(bào)道[3-5]。

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種常見的條件性致病菌，也是一種新的人獸魚共患病原菌，能夠引起陸生動(dòng)物、魚和人的多種不同程度的感染[6]，人在接觸該菌感染的病魚后較易引起感染，對(duì)人類的健康和水產(chǎn)品質(zhì)量安全有潛在的危害。近年來隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)集約化程度的提高，維氏氣單胞菌感染養(yǎng)殖魚類的報(bào)道也逐漸增多，包括團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)、臺(tái)灣泥鰍(Paramisgurnussp.)、鱖(Sinipercachuatsi)、斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)等常見養(yǎng)殖品種，一旦感染會(huì)造成魚類的大量死亡，極大地威脅了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[7-10]。

2015年6月湖北省荊州市某水蛭養(yǎng)殖場(chǎng)的日本醫(yī)蛭發(fā)生死亡，患病水蛭主要表現(xiàn)為為胸腹部肌肉腫脹和結(jié)節(jié)，反應(yīng)遲緩，進(jìn)食停止等癥狀，經(jīng)檢查無寄生蟲感染，死亡率較高。本試驗(yàn)以患病日本醫(yī)蛭病原菌為研究對(duì)象，經(jīng)細(xì)菌分離、回歸感染、生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定確定該病原為維氏氣單胞菌。進(jìn)一步檢測(cè)了該菌株對(duì)常見抗菌藥物的敏感性以及恩諾沙星與天然化合物的協(xié)同用藥研究，為水蛭養(yǎng)殖過程中維氏氣單胞菌感染的科學(xué)治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

患病日本醫(yī)蛭采自湖北省荊州市某養(yǎng)殖場(chǎng)；回歸試驗(yàn)用的日本醫(yī)蛭來自周邊未發(fā)病的養(yǎng)殖場(chǎng)；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基購自青島海博生物公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、PCR Master Mix購自北京天根生化公司；恩諾沙星、天然化合物標(biāo)準(zhǔn)品購自中國(guó)食品藥品檢定研究院，恩諾沙星和天然化合物分別溶于稀醋酸和DMSO制備成儲(chǔ)存液。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

取患病水蛭在無菌條件下用無菌生理鹽水沖洗表面3～5次，在腫脹、結(jié)節(jié)部位剖取肌肉，用無菌玻璃勻漿器勻漿后用接種環(huán)接種至腦心浸液肉湯(BHI)培養(yǎng)基，在30 ℃培養(yǎng)16～18 h。挑取疑似菌落純化3次，將純化的細(xì)菌標(biāo)記為JZ15062301在BHI培養(yǎng)18 h后加入30%的無菌甘油，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 回歸感染試驗(yàn)

在無菌工作臺(tái)中挑取JZ15062301單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜以復(fù)蘇菌種，然后在無菌條件下按照麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ脽o菌生理鹽水將菌液稀釋為1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105CFU/mL四個(gè)不同的濃度梯度。每個(gè)試驗(yàn)組20條健康日本醫(yī)蛭，背部注射不同濃度菌液，陰性對(duì)照組注射無菌生理鹽水[4]。試驗(yàn)用日本醫(yī)蛭養(yǎng)殖在50 L玻璃水族箱中，水溫保持在23～25 ℃；氣石充氣，溶解氧保持在5.5～7.5 mg/L；每天更換50%(體積)的水，不投喂飼料。觀察并記錄水蛭的死亡情況，移除死亡水蛭，計(jì)算其半數(shù)致死濃度(LC50)。對(duì)出現(xiàn)同天然發(fā)病類似癥狀的水蛭按照1.2的方法進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.4 致病菌株生理生化鑒定

取純化的JZ15062301單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察菌落形態(tài)特征并進(jìn)行革蘭氏染色，用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。將單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10 000g離心取菌體用無菌生理鹽水稀釋后接種于生化鑒定管，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的方法進(jìn)行生化鑒定[11]。

1.5 致病菌株的分子生物學(xué)鑒定

按照細(xì)菌基因組提取試劑盒的操作說明來提取菌株JZ15062301的全基因組，使用16s rRNA通用引物擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后送至上海生工生物公司進(jìn)行序列測(cè)定并用BLAST軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)。采用MEGA5.1軟件以Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，校正模型為Kimura 2-parameter，Bootstraps法檢測(cè)1 000次。

1.6 藥物敏感性試驗(yàn)

1.6.1 K-B法測(cè)定致病菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性

在無菌條件下挑取單菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)6～8 h。培養(yǎng)好的菌液離心(5 000g，4 ℃)5 min，將上清棄去后用無菌生理鹽水將菌體重懸并用麥?zhǔn)媳葷峁軐⒕簼舛日{(diào)整至1.5×108CFU/mL。將菌液均勻地涂布在MH固體培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后測(cè)定抑菌圈直徑。敏感性參照杭州微生物試劑有限公司提供的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

1.6.2 肉湯微量稀釋法測(cè)定恩諾沙星和天然化合物的最小抑菌濃度

采用CLSI推薦肉湯微量稀釋法測(cè)定了抗菌藥物和天然化合物的最小抑菌濃度(MICs)[12]。將受試藥物在無菌96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中倍比稀釋,使每孔中藥物的體積為100 μL。菌液用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝缓笙♂?50倍，加入100 μL菌懸液使其在每孔中的終濃度為5×105CFU/mL。設(shè)置陽性(加菌不加藥)對(duì)照和陰性(不加菌不加藥)對(duì)照，每種藥物做三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，在30 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，以沒有細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度判定為該藥物的最低抑菌濃度。

1.6.3 棋盤式微量稀釋試驗(yàn)測(cè)定恩諾沙星和天然化合物的聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

采用CLSI公布的方法測(cè)定天然化合物與抗菌藥物組合對(duì)JZ15062301菌株的聯(lián)合抑菌作用[13]。將受試藥物分別在1.5 mL無菌離心管中倍比稀釋，在無菌條件下分別取50 μL藥物加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。使抗菌藥物共加入9孔(2～10行)并且濃度從左到右依次降低，天然化合物共加入7孔(B-H列)并且從上到下濃度依次降低。A2～A10和1B-1H孔中補(bǔ)加50 μL的培養(yǎng)基補(bǔ)足體系。菌液用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整至0.5麥?zhǔn)蠁挝缓笙♂?50倍，取100 μL菌液加入體系使其在體系的終濃度為5×105CFU/mL，設(shè)置陽性(加菌不加藥)對(duì)照和陰性(不加菌不加藥)對(duì)照，每種藥物做三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，在30 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h后觀察結(jié)果，記錄藥物單獨(dú)使用和聯(lián)合以后的MIC值。通過抑菌濃度指數(shù)FICI (fractional inhibitory concentration index)評(píng)價(jià)藥物聯(lián)合使用的效果，計(jì)算公式如下：

FICI= MICA藥聯(lián)合/MICA藥單獨(dú)+MICB藥聯(lián)合/

MICB藥單獨(dú)

當(dāng)FICI≤ 0.5兩種藥物為協(xié)同作用 (Synergism，SYN)；當(dāng)0.5< FICI≤ 4時(shí)為無關(guān)作用 (indifference，IND)；當(dāng)FICI> 4時(shí)為拮抗作用(antagonism，ANT)[14]。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的培養(yǎng)特性

從患病日本醫(yī)蛭的腫脹和結(jié)節(jié)部位取組織進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果分離到的菌株在培養(yǎng)基上經(jīng)過培養(yǎng)后形成圓形光滑、顏色灰白、邊緣整齊且隆起的不透明菌落，經(jīng)革蘭氏染色和鏡檢發(fā)現(xiàn)該分離株為革蘭氏陰性短桿菌。

表1 JZ15062301菌株的生化特性Tab.1 Biochemical characterization of JZ15062301 isolate

注+，≥90%的菌株為陽性；-，≥90%的菌株為陰性。

2.2 回歸感染結(jié)果

健康日本醫(yī)蛭在感染后24 h后開始出現(xiàn)死亡，1.5×108CFU/mL濃度組出現(xiàn)死亡的時(shí)間較早，感染后24 h即開始出現(xiàn)死亡，于感染后的4 d全部死亡。感染后未死亡的日本醫(yī)蛭在7 d后開始出現(xiàn)癥狀，主要表現(xiàn)為感染部位的皮膚和肌肉腫脹，至感染后12 d低濃度組部分患病日本醫(yī)蛭出現(xiàn)肌肉結(jié)節(jié)甚至潰爛癥狀，陰性對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況。經(jīng)Bliss法計(jì)算JZ15062301菌株對(duì)健康日本醫(yī)蛭的半數(shù)致死濃度(LC50)為7.75×105CFU/mL。取死亡和癥狀明顯的患病日本醫(yī)蛭進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離得到了與攻毒菌株JZ15062301理化性狀一致的細(xì)菌。

2.3 致病菌株的生化鑒定

分離菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示，結(jié)合該菌株的菌落形態(tài)和革蘭氏染色結(jié)果，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》的判定標(biāo)準(zhǔn)初步鑒定該菌株為維氏氣單胞菌。

2.4 致病菌株的分子生物學(xué)鑒定

使用16S rRNA通用引物擴(kuò)增后可以得到長(zhǎng)度約為1.5 kb的基因序列?；驕y(cè)序結(jié)果表明，該菌株16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1 453 bp。運(yùn)行BLAST程序?qū)⒃撔蛄信cNCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，將同源性較高的序列用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)JZ15062301菌株與維氏氣單胞菌(KU163442.1,KU554699.1,KR070960.1和KU543613.1)親緣關(guān)系最近(圖1)，同源性為99%。綜合分析該分離株的菌落形態(tài)、染色特征、生理生化鑒定結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果可以將該病原菌鑒定為維氏氣單胞菌。

圖1 JZ15062301菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Constructed 16S rRNA phylogenetic tree of JZ15062301 by MEGA 5.1

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 常用抗菌藥物的敏感性

本試驗(yàn)采用K-B法測(cè)定了分離株JZ15062301對(duì)20種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果如表2所示。該分離株對(duì)妥布霉素、氟苯尼考等4種藥物敏感，對(duì)阿米卡星、大觀霉素、環(huán)丙沙星和磺胺異噁唑4種藥物中度敏感，對(duì)青霉素、頭孢拉定、阿莫西林、恩諾沙星等12種藥物耐藥。

2.5.2 恩諾沙星與天然化合物的最小抑菌濃度

結(jié)果如表3所示，恩諾沙星的MIC值為32 μg/mL，天然化合物的MIC在32～512 μg/mL之間。其中白藜蘆醇、二氫楊梅素的抑菌活性最強(qiáng)，其MIC值均為32 μg/mL，而咖啡酸抑菌活性最差，其MIC值為512 μg/mL。

2.5.3 體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

如表3所示，異土木香內(nèi)酯與恩諾沙星聯(lián)合使用后其MIC顯著下降，F(xiàn)ICI指數(shù)為0.25 (FICI<0.5)。因此根據(jù)1.8中提到的判定方法判定異土木香內(nèi)酯與恩諾沙星聯(lián)合使用在體外具有協(xié)同抗菌作用。

表2 JZ15062301對(duì)20種抗菌藥物的敏感性Tab.2 Sensitivity of JZ15062301 strain to 20 kinds of antibiotics

注：S，敏感；I，中度敏感；R，耐藥

表3 天然化合物與恩諾沙星(單獨(dú)或聯(lián)合)對(duì)JZ15062301菌株的MICTab.3 The MIC values of natural compounds and enrofloxacin (alone or combined)against JZ15062301 strain

注：SYN：協(xié)同作用；IND，無關(guān)作用。

3 討論

維氏氣單胞菌是一種常見的條件性致病菌，廣泛分布于水環(huán)境中。大量研究表明，當(dāng)水質(zhì)惡化、養(yǎng)殖動(dòng)物外傷及免疫力低下時(shí)極易感染該菌，水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物一旦感染該菌后會(huì)出現(xiàn)皮膚潰爛、臟器出血和腹水等癥狀，死亡率較高，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[15]。胡秀彩等[16]從患病蝶尾金魚中分離到一株致病性維氏氣單胞菌，是造成蝶尾金魚脫鱗和出血的病原菌，人工感染24 h后可造成100%的死亡率。陸夢(mèng)瑩等[17]從患病懷頭鯰肝臟等組織中分離到一株致病性維氏氣單胞菌，人工感染后可導(dǎo)致體表出血、腹水等癥狀，且感染魚在72 h內(nèi)死亡率達(dá)100%。常燕等[18]從暗紋東方鲀體內(nèi)分離到維氏氣單胞菌，其對(duì)暗紋東方鲀和小鼠均有較強(qiáng)的致病力，能導(dǎo)致暗紋東方鲀體表充血和出血等癥狀。此外，鄭世雄等[19]發(fā)現(xiàn)維氏氣單胞菌可以引起池塘養(yǎng)殖的中華絨螯蟹死亡，人工感染發(fā)現(xiàn)該菌可在24 h內(nèi)導(dǎo)致感染中華絨螯蟹全部死亡，且其癥狀與自然發(fā)病相同。本試驗(yàn)從有結(jié)節(jié)癥狀的日本醫(yī)蛭中分離到了一株病原菌，經(jīng)過對(duì)其生理生化特征分析、16S rRNA保守序列測(cè)序和構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)該菌株與維氏氣單胞菌的同源性高達(dá)99%，結(jié)合生理生化特性將該菌株鑒定為維氏氣單胞菌。菌株經(jīng)回歸感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可以導(dǎo)致健康日本醫(yī)蛭出現(xiàn)結(jié)節(jié)甚至皮膚潰爛等癥狀，從回歸感染的患病水蛭分離的病原菌的生理生化特性和16S rRNA保守序列與分離株JZ15062301一致，因此確認(rèn)分離株JZ15062301為導(dǎo)致日本醫(yī)蛭產(chǎn)生結(jié)節(jié)和水腫癥狀的病原菌。

抗菌藥物內(nèi)服是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)治療維氏氣單胞菌感染的主要方法，但由于藥物的濫用導(dǎo)致維氏氣單胞菌耐藥性嚴(yán)重[20]。耿昕穎等[21]研究了不同魚類來源的維氏氣單胞菌的耐藥情況發(fā)現(xiàn)所試驗(yàn)菌株耐藥性嚴(yán)重且呈多重耐藥性，對(duì)多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶和阿米卡星等5種常用藥物的耐藥率超過70%，對(duì)恩諾沙星的耐藥率為57.69%，所有試驗(yàn)菌株對(duì)氟苯尼考均較為敏感。周光等[22]研究了56株團(tuán)頭魴養(yǎng)殖池維氏氣單胞菌的致病性和耐藥性發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌對(duì)大部分受試抗菌藥物耐藥，平均耐藥率達(dá)73%，而且其發(fā)現(xiàn)能夠?qū)е卖~發(fā)病的菌株多為耐藥譜較廣的菌株。本試驗(yàn)中所鑒定的病原菌對(duì)妥布霉素、氟苯尼考、頭孢噻肟和阿奇霉素四種受試抗菌藥物較為敏感，耐藥率較高；但不同來源的維氏氣單胞菌由于養(yǎng)殖環(huán)境、用藥習(xí)慣等不同導(dǎo)致該分離株的耐藥特點(diǎn)與以往報(bào)道有差異。因此提示我們?cè)陴B(yǎng)殖過程中如發(fā)生細(xì)菌性病害應(yīng)及時(shí)進(jìn)行病原分離和藥敏試驗(yàn)以篩選出敏感藥物有針對(duì)性地進(jìn)行治療。

盡管目前臨床分離的致病性維氏氣單胞菌仍有有效的抗生素進(jìn)行治療，但抗生素所帶來的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和耐藥性風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起人們的高度重視，因此逐漸將抗菌藥物的研究轉(zhuǎn)向了中藥替代抗生素的研究。王德強(qiáng)等[23]采用棋盤交叉法研究了14種中草藥聯(lián)合復(fù)方對(duì)羅非魚無乳鏈球菌的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6種中草藥復(fù)方具有協(xié)同作用。吳亮等[24]通過瓊脂培養(yǎng)法測(cè)定了氟苯尼考與4種中藥復(fù)方協(xié)同抑菌作用，結(jié)果篩選到34種復(fù)方對(duì)15株鰻鱺病原菌有協(xié)同和相加作用。盧靜等[25]研究了抗生素與中藥單體的協(xié)同抑菌作用，發(fā)現(xiàn)沒食子酸與恩諾沙星聯(lián)合應(yīng)用對(duì)溫和氣單胞菌具有協(xié)同抑菌作用。以上研究結(jié)論表明中藥與抗生素協(xié)同用藥策略可以降低抗生素和中藥的MIC，從而降低治療后藥物在水產(chǎn)品中的殘留，在抑制水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌感染上有較好的前景。本試驗(yàn)采用天然化合物標(biāo)準(zhǔn)品作為試驗(yàn)對(duì)象，有效避免了因中藥提取工藝和條件不同對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的影響。通過最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)天然化合物對(duì)JZ15062301菌株的MIC值分布在32～512 μg/mL之間，其中白藜蘆醇和二氫楊梅素的MIC值最低，均為32 μg/mL。進(jìn)一步通過對(duì)受試藥物的棋盤式微量稀釋試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，異土木香內(nèi)酯與恩諾沙星聯(lián)合使用后兩種藥物對(duì)JZ15062301菌株的MIC值均下降了87.5%，其FICI指數(shù)為0.25，具有協(xié)同抑菌作用，其他藥物與恩諾沙星聯(lián)合使用后盡管MIC值均有不同程度的下降，但其FICI指數(shù)均大于0.5，因此不具有協(xié)同抑菌作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，異土木香內(nèi)酯與恩諾沙星聯(lián)合使用可以降低兩種藥物的濃度，提高藥物敏感性，對(duì)于延長(zhǎng)恩諾沙星的使用壽命和降低臨床使用劑量有重要意義。