盧徐斌，姜 群，閔 悅，姜 熙，楊章平，孫龍生，張曉君

(揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 江蘇揚(yáng)州 225009)

甲殼動物在生長發(fā)育的過程中會周期性地生成新的外骨骼、蛻掉舊的外骨骼，這種現(xiàn)象稱為蛻皮，蛻皮貫穿個體發(fā)育的始終，使甲殼動物出現(xiàn)階梯式生長[1]。掌握甲殼動物的蛻皮規(guī)律，對開展蛻皮的調(diào)控和生長相關(guān)研究具有重要意義，而探究蛻皮周期的劃分是開展其他研究的基礎(chǔ)和前提。目前甲殼動物蛻皮周期劃分有兩種方法，分別是形態(tài)特征觀察法和顯微結(jié)構(gòu)觀察法。形態(tài)特征觀察法簡潔實(shí)用，適用于所有十足目甲殼動物，但不夠精細(xì)準(zhǔn)確。顯微結(jié)構(gòu)觀察法較為精準(zhǔn)，但耗時(shí)長且較繁瑣，不適宜現(xiàn)場采樣和樣品數(shù)量較大時(shí)采用[2]，因此開發(fā)出一種快速且準(zhǔn)確的周期劃分方法尤為重要。甲殼動物蛻皮周期的劃分一般分為蛻皮后期、蛻皮間期、蛻皮前期和蛻皮期，其中蛻皮前期又可分為不同的亞期，劃分依據(jù)在不同物種中有所差異，例如：王戰(zhàn)芳[3]依據(jù)步足末端剛毛、羽小枝及內(nèi)部圓錐的變化，將中華鋸齒米蝦(Neocaridinadenticulatasinensis)的蛻皮前期細(xì)分為 D0-1亞期和D2-4亞期2個亞期；Tian等[4]依據(jù)第三顎足外肢末端結(jié)構(gòu)特征及剛毛的形態(tài)特征將中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)的蛻皮前期細(xì)分為D0、D1和D2-4期，因此應(yīng)針對具體物種確定其特有的劃分依據(jù)。

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii) 又稱馬來西亞大蝦或泰國蝦，其食性廣、生長快、肉質(zhì)鮮嫩，是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦種之一[5-6]，也是我國重要淡水經(jīng)濟(jì)蝦類，2016年全國羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)13.27萬噸[7]。1977年，John等[8]根據(jù)外骨骼色素回縮和顯微觀察等方法對羅氏沼蝦蛻皮周期進(jìn)行劃分，但是羅氏沼蝦活體中難以區(qū)分外骨骼與新表皮之間的色素，使得色素回縮的特征難以辨認(rèn)。而且，John文章中的顯微觀察的圖片分辨率較低，且缺少不同亞期的圖片，因此羅氏沼蝦蛻皮周期劃分的標(biāo)準(zhǔn)有待更新。本研究采用形態(tài)特征和顯微觀察相結(jié)合的方法，建立了一種快速準(zhǔn)確劃分羅氏沼蝦蛻皮周期的方法，為蛻皮相關(guān)研究提供基礎(chǔ)。另外，近年來，羅氏沼蝦養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn)，部分個體生長緩慢，上市季節(jié)難以達(dá)到商品規(guī)格，嚴(yán)重影響?zhàn)B殖的產(chǎn)量與效益[9]。針對這一現(xiàn)象，本研究通過分析不同生長速度群體的蛻皮周期和蛻皮頻率，探索蛻皮對羅氏沼蝦生長的影響，以期為羅氏沼蝦的科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 羅氏沼蝦蛻皮周期劃分方法的建立

實(shí)驗(yàn)采用6尾稚蝦(2.08±0.01)g和6尾成蝦(6.94±0.42) g為材料，進(jìn)行蛻皮周期的觀察，所有實(shí)驗(yàn)樣品飼養(yǎng)于相同水體不同隔間內(nèi)，每日觀察其形態(tài)特征，剪游泳足末端置于OLYMPUS CX21FS顯微鏡下進(jìn)行顯微觀察并拍照，日投餌2次，投喂量約為體重的4%，日換水1/3體積，連續(xù)充氧，飼養(yǎng)周期40 d。

1.2 蛻皮頻率對羅氏沼蝦生長速度的影響

本研究采用1個生長緩慢群體(E1組)作為實(shí)驗(yàn)組，2個正常生長群體(C1和C2組)作為對照組，每組設(shè)三個重復(fù)(表1)。E1和C1組取自同一蝦塘，約140日齡，取18尾小規(guī)格蝦(1.97±0.24) g作為E1組，18尾大規(guī)格蝦(6.28±0.47) g作為C1組；C2組樣品來自另一蝦塘，約80日齡，規(guī)格與E1相仿(1.95±0.19) g。每6尾蝦置于一個水族箱內(nèi)飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件同上，每天記錄蛻皮次數(shù)，飼養(yǎng)周期為44 d。蛻皮頻率的計(jì)算公式為：蛻皮頻率=蛻皮總次數(shù)/(飼養(yǎng)天數(shù)×每箱蝦尾數(shù))，每組蝦的蛻皮頻率結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并用 SAS 9.2進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，通過Duncan檢測方法進(jìn)行組間差異顯著性分析，P<0.05時(shí)差異顯著。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品分組信息Tab.1 Basic information about samples in this study

2 結(jié)果

2.1 羅氏沼蝦蛻皮周期的劃分

結(jié)合形態(tài)特征和顯微觀察法，將羅氏沼蝦的蛻皮周期劃分為蛻皮后期(A期和B期)、蛻皮間期(C期)、蛻皮前期(D期)和蛻皮期(E期)四個周期，其中蛻皮后期可細(xì)分為A期和B期，蛻皮前期可細(xì)分為D0期、D1期、D2期和D3期四個亞期，2種不同規(guī)格的羅氏沼蝦的蛻皮周期如表2所示，其中體重約為2 g的稚蝦蛻皮周期約為15 d，體重約為7 g的成蝦蛻皮周期約為19 d。

2.1.1 蛻皮后期(A-B期)

羅氏沼蝦蛻皮后，體內(nèi)水分含量較高，體積較蛻皮前有所增加[10]，頭胸甲和身體十分柔軟，此周期為蛻皮后期。蛻皮后期又可細(xì)分為A期和B期：A期的羅氏沼蝦額劍柔軟可彎曲，個體離開水面后第二步足不能正常抬起(圖1)。之后，羅氏沼蝦進(jìn)入蛻皮后期的B期，此時(shí)頭胸甲和外表皮依舊柔軟，略硬于A期，額劍變硬不能自由彎曲，蝦體離開水面后第二步足可以正常抬起，剪游泳足末端置于顯微鏡下觀察，剛毛腔充滿半透明纖維狀基質(zhì)，羽小枝排列均勻且清晰可見，剛毛內(nèi)錐正在發(fā)育，尚未完全形成(圖2)。

表2 羅氏沼蝦稚蝦和成蝦的蛻皮周期Tab.2 Molt cycle of juvenile and adult Macrobrachium rosenbergii

圖1 羅氏沼蝦的蛻皮后期(A期)Fig.1 Postmolt stage (A) of M.rosenbergiiduring the molt cycle

圖2 羅氏沼蝦的蛻皮后期(B期)Fig.2 Postmolt stage (B) of M.rosenbergiiduring the molt cycle

2.1.2 蛻皮間期(C期)

羅氏沼蝦在蛻皮間期表皮逐漸鈣化，外骨骼逐漸變硬，此階段游泳足末端剛毛內(nèi)錐形成(圖3)。蛻皮間期，羅氏沼蝦大量攝食，營養(yǎng)物質(zhì)開始逐漸積累，為下一次的蛻皮進(jìn)行物質(zhì)準(zhǔn)備，這一階段持續(xù)時(shí)間較長。

2.1.3 蛻皮前期(D期)

蛻皮前期主要為蛻皮作形態(tài)上、生理上準(zhǔn)備，該階段變化較大，可分為四個亞期。取游泳足末端置于顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)，D0期表現(xiàn)為表皮松散，出現(xiàn)新剛毛，新剛毛形狀短小，略彎曲，上皮組織與外骨骼之間發(fā)生分離且上皮組織外緣形狀不規(guī)則(圖4)；D1期，上皮組織與外骨骼之間分離更加明顯，兩者之間形成回縮區(qū)，且上皮組織呈扇形，新剛毛逐漸生長，慢慢進(jìn)入到舊剛毛內(nèi)部(圖5)；羅氏沼蝦進(jìn)入到蛻皮前期的D2期，新剛毛擁有清晰的輪廓，新生表皮明顯內(nèi)折且表面沿著新生剛毛反方向形成一種管狀結(jié)構(gòu)，排列有序，John[8]稱這種結(jié)構(gòu)為“剛毛器官”，在中華鋸齒米蝦中稱之為管形套結(jié)構(gòu)[3]；D2期“剛毛器官”不明顯，形狀較細(xì)，顏色較淺(圖6)；D3期“剛毛器官”結(jié)構(gòu)極其明顯，寬度增加，顏色也變深(圖7)。

圖3 羅氏沼蝦的蛻皮間期(C期)Fig.3 Intermolt stage (C) of M.rosenbergii during the molt cycle

圖4 羅氏沼蝦的蛻皮前期(D0期)Fig.4 Premolt stage (D0) of M.rosenbergii during the molt cycle

圖5 羅氏沼蝦的蛻皮前期(D1期)Fig.5 Premolt stage (D1) of M.rosenbergii during the molt cycle

圖6 羅氏沼蝦的蛻皮前期(D2期)Fig.6 Premolt stage (D2) of M.rosenbergii during the molt cycle

圖7 羅氏沼蝦的蛻皮前期(D3期)Fig.7 Premolt stage (D3) of M.rosenbergii during the molt cycle

2.1.4 蛻皮期 (E期)

羅氏沼蝦的蛻皮過程大多在夜間進(jìn)行[11]。蝦從蛻皮前期(D期)攝食量開始減少，羅氏沼蝦在蛻皮時(shí)一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，有時(shí)會前后左右晃動。蛻皮時(shí)，頭胸甲和腹部結(jié)合處裂開，新生的頭胸甲從裂縫中脫出，然后通過有力的跳動將頭部從舊殼蛻出。羅氏沼蝦的整個蛻皮過程一般在數(shù)分鐘內(nèi)結(jié)束。蛻皮后，羅氏沼蝦的新生蝦體柔軟，大概十幾個小時(shí)不能正常游泳和爬行，僅可以彈跳，此時(shí)非常容易受到同類或其它敵害的傷害(圖8)。

圖8 羅氏沼蝦蛻皮期(E期)蛻下的外骨骼Fig.8 The exoskeleton of M.rosenbergii during the molt stage (E)

2.2 蛻皮頻率對羅氏沼蝦生長速度的影響

羅氏沼蝦不同生長速度群體的蛻皮頻率見表3。140日齡生長緩慢組(E1)、140日齡正常生長組(C1)和80日齡正常生長組(C2)的蛻皮頻率分別為0.089 2，0.074 2和0.123 7，其中不同日齡、不同規(guī)格的兩個正常生長組(C1和C2)之間差異顯著(P<0.05)，其他組間差異不顯著。C1組和C2組的比較表明，隨著生長時(shí)間的增加和樣品規(guī)格的增大，羅氏沼蝦蛻皮頻率顯著降低，即蛻皮周期延長，說明羅氏沼蝦的蛻皮周期受個體年齡和規(guī)格的影響；E1和C2組的比較表明，規(guī)格相同，生長時(shí)間和生長速度不同的群體中，生長速度較慢的群體的蛻皮頻率較小(蛻皮周期較長)，兩者之間的差異可能受年齡的影響；E1和C1組的比較表明，生長時(shí)間相同，生長速度不同的群體間的蛻皮頻率相差不大，生長緩慢組的蛻皮頻率雖略高于正常生長群體，這可能與個體規(guī)格差異有關(guān)。綜上，羅氏沼蝦的蛻皮頻率(蛻皮周期)受年齡和個體規(guī)格因素的影響，蛻皮頻率對羅氏沼蝦生長的影響不顯著，蛻皮頻率可能并不是導(dǎo)致羅氏沼蝦生長緩慢的主要原因。

表3 生長緩慢的羅氏沼蝦與正常生長的羅氏沼蝦蛻皮頻率的比較Tab.3 The comparison of molting frequency between slow-growth and the normal-growth M.rosenbergii

注：E1：140日齡生長緩慢組；C1：140日齡正常生長組；C2：80日齡正常生長組；a/b：顯著性檢驗(yàn)(字母不同表示差異顯著(P<0.05)).

3 討論

3.1 羅氏沼蝦蛻皮周期的劃分

甲殼類蛻皮周期的準(zhǔn)確劃分是研究蛻皮調(diào)節(jié)機(jī)制和開展生產(chǎn)實(shí)踐的基礎(chǔ)。不同物種中，蛻皮周期的劃分依據(jù)有相似點(diǎn)，也有物種特有的結(jié)構(gòu)特征。例如Turnbull[12]依據(jù)剛毛發(fā)育情況、表皮收縮和內(nèi)陷程度將錦繡龍蝦(Panulirusornatus)蛻皮周期分成 A、B、C、D0、D1′、D1″和D2等7 個時(shí)期；Moriyasu等[13]依據(jù)小顎內(nèi)肢基部表皮回縮和新生剛毛進(jìn)入管鞘程度將雪蟹(Chionoecetesopilio)蛻皮周期分為蛻皮后期、蛻皮間期和蛻皮前期，其中蛻皮前期又細(xì)分為D0、D1和D3-4三個亞期；沈潔等[2]依據(jù)游泳足趾節(jié)末端新舊表皮基線間距/舊表皮厚度的比值(R值)，將三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的蛻皮前期細(xì)分為D0期(0

3.2 羅氏沼蝦蛻皮對生長的影響分析

蛻皮是甲殼動物生長的基礎(chǔ)，伴隨著蛻皮，甲殼動物的體重在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)一次跨越式增長[14]，而在蛻皮之后至下一次蛻皮前，體重幾乎很少增加[15-16]，因此探索蛻皮頻率對生長速度的影響，對于生產(chǎn)實(shí)踐具有重要意義，然而，影響甲殼動物蛻皮的因素很多，如個體的年齡[17]、規(guī)格以及各種外源因子[18-19]、光照、鹽度、鈣離子[20]、餌料與污染物等都會影響蛻皮頻率，因此本研究分別選取了與實(shí)驗(yàn)組相同規(guī)格和相同年齡的羅氏沼蝦群體作為對照組，并將所有實(shí)驗(yàn)樣品飼養(yǎng)于相同的環(huán)境中，盡量避免了外源因子的干擾，確保了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。本研究的結(jié)果表明，蛻皮頻率并沒有顯著影響羅氏沼蝦的生長，推測蛻皮頻率可能并不是導(dǎo)致羅氏沼蝦生長緩慢的主要原因，這一結(jié)果與劉志沖等人的研究結(jié)果一致，劉志沖等人發(fā)現(xiàn)，餌料中加入β-蛻皮激素只能促進(jìn)羅氏沼蝦的蛻皮，對生長沒有顯著的促進(jìn)作用[21]。然而，黃凱等[22]的研究發(fā)現(xiàn)較低的蛻皮率會限制羅氏沼蝦的生長速度。陳樹橋等[23]在克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的研究中發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量蛻皮激素提高克氏原螯蝦(P.clarkii)幼蝦的蛻皮頻率，并對其體長和體重增加起到顯著促進(jìn)作用(P<0.05)；羅日祥等[24]在中國對蝦(Penaeusorientals)的研究中也發(fā)現(xiàn)，餌料中添加β-蛻皮激素和水龍骨素B的混合物有助于對蝦的蛻皮和生長。不同的研究結(jié)果表明，蛻皮頻率對甲殼動物生長速度的影響需要后期更為深入的研究。

除蛻皮頻率外，甲殼動物的生長與每次蛻皮時(shí)體長與體重的增加程度有關(guān)。黃國強(qiáng)[15]在中國對蝦稚蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，在較低的攝食水平下，中國對蝦可以正常蛻皮，但每次蛻皮體重增長極低甚至出現(xiàn)負(fù)增長，說明蛻皮只為對蝦的身體生長提供機(jī)會，充足的餌料供應(yīng)和優(yōu)良營養(yǎng)條件等其他因素對生長速度影響重大。本研究實(shí)驗(yàn)組中的羅氏沼蝦來源于同一池塘，其餌料供應(yīng)及外界條件相似，但卻出現(xiàn)了較大的生長差異，說明除餌料和營養(yǎng)條件外，還有其他的因素影響羅氏沼蝦生長。羅氏沼蝦生長緩慢的現(xiàn)象已嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益，然而引起該現(xiàn)象的原因尚未查明，目前僅有少數(shù)學(xué)者對其進(jìn)行探究：董學(xué)洪等[9]對生長緩慢的羅氏沼蝦進(jìn)行研究，認(rèn)為餌料營養(yǎng)不足、水質(zhì)條件較差以及苗種質(zhì)量等原因可導(dǎo)致羅氏沼蝦生長緩慢；安振華等[25]則認(rèn)為幼體營養(yǎng)不足和養(yǎng)殖過程濫用抗生素可能是導(dǎo)致羅氏沼蝦生長緩慢的因素；本研究以蛻皮頻率為切入點(diǎn)進(jìn)行分析，為揭示羅氏沼蝦生長緩慢現(xiàn)象提供了新的視角。然而，羅氏沼蝦生長緩慢現(xiàn)象產(chǎn)生原因較為復(fù)雜，探索該現(xiàn)象發(fā)生的原因并尋求相應(yīng)的解決方法將有利于羅氏沼蝦產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。