肖 敏，樂志艷

(撫州市食品藥品檢驗(yàn)所質(zhì)控科，江西 撫州 344000)

胃酸相關(guān)性疾病是一類胃酸與發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)的上消化道疾病，主要包括反流性食管炎、胃腸道潰瘍、胃炎、消化不良、十二指腸潰瘍、卓-艾綜合征、腸道十二指腸炎及非甾體抗炎藥引發(fā)的消化道疾病等，在發(fā)達(dá)國家較為常見。該病是臨床上最常見多發(fā)的消化系統(tǒng)疾病之一，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1-5]。因此，抑酸強(qiáng)度更高、抑酸持續(xù)時(shí)間更長的抗胃酸藥的開發(fā)成了當(dāng)務(wù)之急[6]。富馬酸沃諾拉贊是由日本武田制藥研發(fā)的鉀離子(K+)競爭性酸阻滯劑((potassium competitive acid blocker，P-CAB)的新型可逆性質(zhì)子泵抑制劑，藥物原型發(fā)揮作用起效迅速，且半衰期長，抑酸作用顯著，能夠在胃壁細(xì)胞胃酸分泌的最后一步通過抑制K+對H+-K+-ATP酶(質(zhì)子泵)的結(jié)合作用，提前終止胃酸的分泌，具有強(qiáng)勁、持久的抑制胃酸分泌作用，對糜爛性食管炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍及幽門螺桿菌感染等胃酸相關(guān)性疾病療效良好[6-12]。該藥具有全新的靶點(diǎn)，對質(zhì)子泵的抑制作用無需酸的激活，以高濃度進(jìn)入胃中，首次給藥便能產(chǎn)生最大的抑制效應(yīng)，且可持續(xù)24 h。該藥在酸中穩(wěn)定，藥效及起效劑量在不同患者中的差異并不顯著，療效和安全性良好[13-14]?；谝陨咸攸c(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)，富馬酸沃諾拉贊有望成為新的治療藥物，以解決當(dāng)前酸相關(guān)疾病治療中存在的問題，市場前景十分良好。富馬酸沃諾拉贊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未被《中華人民共和國藥典》收載[15]，本研究旨在通過高效液相色譜法分辨率和靈敏度高、分析速度快、重復(fù)性好及定量精度高等的特點(diǎn)，建立富馬酸沃諾拉贊的含量測定方法，為今后該藥的開發(fā)利用提供質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2030C型液相色譜儀(配有四元泵、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、二極管陣列檢測器及化學(xué)工作站，島津公司)；CPA225D型電子天平[賽多利斯科學(xué)化學(xué)(北京)有限公司]。

1.2 藥品與試劑

富馬酸沃諾拉贊對照品(某醫(yī)藥科技有限公司，批號：150621，含量99.8%)；富馬酸沃諾拉贊原料藥(某醫(yī)藥科技有限公司，批號：150301、150715、150801、151012、161101及161102)；水為超純水；乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18柱(4.6 mm×150 mm，2.5 μm)；流動相為0.01 mol/L磷酸鈉溶液(取磷酸鈉3.8 g，置于1 000 ml容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.8)-乙腈(V∶V=75∶25)；檢測波長為230 nm；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為10 μl；柱溫為30 ℃。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密稱取富馬酸沃諾拉贊對照品適量，加流動相超聲溶解并稀釋制成每1 ml約含0.2 mg的溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，富馬酸峰的分離度為3.3，理論塔板數(shù)為3 750；沃諾拉贊峰的分離度為18.6，理論塔板數(shù)為8 994；連續(xù)進(jìn)樣精密度中富馬酸的RSD為0.18%，沃諾拉贊的RSD為0.15%，能滿足本品含量測定要求。因此，規(guī)定富馬酸峰及沃諾拉贊峰與相鄰的雜質(zhì)峰分離度應(yīng)符合要求，理論板數(shù)按沃諾拉贊峰計(jì)算不得<2 000，峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不得>2.0%。色譜圖見圖1。

2.3 專屬性試驗(yàn)

本品在制備、貯存及使用過程中，不可避免地含有或產(chǎn)生少量雜質(zhì)，為考察各種條件下雜質(zhì)降解與主成分的分離情況，選擇了強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)光、高溫及強(qiáng)氧化劑條件進(jìn)行試驗(yàn)。精密稱取供試品約10 mg，置于50 ml容量瓶中，進(jìn)行不同條件下的降解試驗(yàn)。(1)酸破壞：加1 mol/L鹽酸溶液2 ml，破壞21 h，用堿中和。(2)堿破壞：加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 ml，破壞21 h，用酸中和。(3)氧化破壞：加3%的過氧化氫溶液2 ml，室溫(25 ℃)破壞20 h。(4)高溫破壞：在100 ℃水浴條件下，放置9 h。(5)強(qiáng)光破壞：在光照強(qiáng)度為(4 500±500) lx的培養(yǎng)箱照射21.5 h。分別加流動相超聲溶解并稀釋至刻度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，用二極管陣列檢測器掃描，得到色譜圖，見圖2。圖譜顯示，在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫及強(qiáng)光破壞條件下產(chǎn)生的降解物質(zhì)與主峰的分離度均>1.5，空白溶劑無干擾，沃諾拉贊峰和富馬酸純度指數(shù)值均>0.995；表明各主峰均為單一物質(zhì)峰，本法專屬性良好，能滿足含量測定要求。

A.對照品溶液；B.供試品溶液A. reference solution; B. test solution圖1 富馬酸沃諾拉贊的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC of vonoprazan fumarate

圖2 專屬性試驗(yàn)降解圖Fig 2 Degradation map of specificity test

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取富馬酸沃諾拉贊對照品適量，加流動相超聲使其溶解并稀釋制成每1 ml約含0.8 mg的溶液，搖勻，得對照品儲備液。精密量取上述溶液3、4、5、6及7 ml，分別置于20 ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為121.06、161.41、201.77、242.12及282.48 μg/ml的系列對照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=16 019X-28 538，相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。結(jié)果表明，富馬酸沃諾拉贊在121.06～282.48 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，能滿足含量測定要求。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一富馬酸沃諾拉贊對照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果顯示，富馬酸沃諾拉贊峰面積RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取富馬酸沃諾拉贊約20 mg，置于100 ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。同法配制6份，分別取上述溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，6份樣品中富馬酸沃諾拉贊平均含量為99.61%，RSD為0.22%(n=6)，本法重復(fù)性良好。參照重復(fù)性試驗(yàn)的測定方法，在相同的試驗(yàn)室由不同人員、不同的儀器及不同的時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，富馬酸沃諾拉贊的含量為100.06%，RSD為0.52%(n=6)。將以上結(jié)果綜合計(jì)算，表明本品含量測定方法由不同人員、在不同時(shí)間及不同臺儀器上的含量測定結(jié)果為：富馬酸沃諾拉贊的平均含量為99.83%，RSD為0.45%(n=12)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已測含量的富馬酸沃諾拉贊9份，每份約10 mg，分為3組，分別精密加入富馬酸沃諾拉贊對照品8、10及12 mg，置于100 ml容量瓶中，均加流動相溶解并稀釋至刻度。分別取上述溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，記錄色譜圖。結(jié)果表明富馬酸沃諾拉贊的平均回收率為100.40%，RSD為0.79%，本方法回收率良好，結(jié)果見表1。

表1 富馬酸沃諾拉贊的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab 1 Recovery test of vonoprazan fumarate(n=9)

2.8 耐用性試驗(yàn)

根據(jù)《中華人民共和國藥典：四部(2015年版)》通則9 101項(xiàng)下[16]的耐用性試驗(yàn)，考察本品測定結(jié)果不受影響的承受程度，為使本方法可用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。因此，本試驗(yàn)對流速、柱溫、流動相的組成、流動相pH及色譜柱的改變進(jìn)行耐用性試驗(yàn)考察。取“2.7”項(xiàng)下的供試品溶液，改變色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，改變色譜條件中流速、柱溫、pH、流動相的比例及不同色譜柱進(jìn)行含量測定，富馬酸沃諾拉贊含量的檢測結(jié)果無明顯變化，表明了本方法的穩(wěn)定性，見表2。

表2 耐用性試驗(yàn)供試品含量測定結(jié)果Tab 2 Sample content of durability test

2.9 樣品含量的測定

取樣品6批，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件操作，測定富馬酸沃諾拉贊的含量，結(jié)果見表3。

表3 富馬酸沃諾拉贊含量測定結(jié)果Tab 3 Content determination of vonoprazan fumarate

3 討論

在前期實(shí)驗(yàn)中，曾嘗試采用C8、C18色譜柱，流動相采用水-乙腈(V∶V=19∶1)、甲醇-0.05%己烷磺酸鈉溶液(用磷酸調(diào)節(jié)pH至2.5)(V∶V=50 ∶50)、磷酸鹽緩沖液(0.02 mol/L磷酸氫二鉀，用磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0)-乙腈(V∶V=70∶30)、0.01 mol/L磷酸鈉溶液-乙腈(V∶V=75∶25)等條件組合。結(jié)果表明，在采用0.01 mol/L磷酸鈉溶液-乙腈(V∶V=75∶25)為流動相、C18色譜柱的色譜條件時(shí)，富馬酸沃諾拉贊色譜峰形最佳，重復(fù)性最好，峰純度也能滿足測定要求。

依據(jù)本品的特性，采用高效液相色譜法建立了含量測定方法，并對該測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)適用性、專屬性、線性關(guān)系、重復(fù)性、中間精密度、溶液穩(wěn)定性及方法耐用性試驗(yàn)等內(nèi)容的驗(yàn)證。結(jié)果表明，本方法的線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度高，精密度好，方法的耐用性良好。本方法測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，適用于富馬酸沃諾拉贊含量的檢測。