韓方，姜飛，張宇華，張成武

（杭州醫(yī)學(xué)院附屬浙江省人民醫(yī)院 1. 肝膽胰微創(chuàng)外科； 2. 檢驗(yàn)中心，杭州 310014）

胃硬癌也稱作彌漫性浸潤性胃癌，表現(xiàn)為快速增殖未分化的腫瘤細(xì)胞、大量的結(jié)締組織和早期轉(zhuǎn)移的特性［1］，預(yù)后極差［2］。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞在胃硬癌的轉(zhuǎn)移中參與了腫瘤轉(zhuǎn)移、血管的侵入破壞、遠(yuǎn)處定植的過程［3］。研究［4］發(fā)現(xiàn)，干擾成纖維細(xì)胞正常自噬的功能，可以導(dǎo)致其過早衰老。然而，作為衰老影響因素之一的自噬，在胃硬癌對(duì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞中的作用目前仍不十分清楚。本研究以胃硬癌細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的作用為切入點(diǎn)，觀察胃硬癌細(xì)胞條件培養(yǎng)基 （conditioned medium，CM） 對(duì)正常成纖維細(xì)胞的影響，并探討胃硬癌對(duì)腫瘤成纖維細(xì)胞的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究腫瘤與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的相互作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類轉(zhuǎn)移性胃硬癌細(xì)胞系KATOⅢ、胃印戒細(xì)胞癌細(xì)胞NUGC4、人類成纖維細(xì)胞FEF3和WI38，購自美國ATCC公司。FEF3-GFP由FEF3轉(zhuǎn)染熒光素酶質(zhì)粒后構(gòu)建篩選獲得。細(xì)胞培養(yǎng)使用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清，購自美國Inventrogen公司。Western blotting所使用抗體，購自英國Abcam公司或美國Inventrogen公司。mTOR抑制劑雷帕霉素，購自美國Sigma公司。細(xì)胞衰老檢測(cè)使用C0602 Cellular Senescence Detection Kit SA-β-Gal Staining，購自上海Beyotime公司。CCK-8試劑盒，購自日本Dojindo公司。以上試劑盒配置和使用均按照說明書進(jìn)行操作。

1.2 方法

1.2.1 CM的制備和成纖維細(xì)胞的處理：將對(duì)數(shù)生長期的KATOⅢ和NUGC4腫瘤細(xì)胞系種于6孔板上，10%血清穩(wěn)定24 h，換無血清培養(yǎng)基1 mL培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)基離心取上清。后使用NaHCO3或HCl調(diào)節(jié)至pH=7.3，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后，CM制備成功。FEF3/FEF3-GFP和WI38細(xì)胞穩(wěn)定24 h后，更換為CM，每24 h拍照觀察。

1.2.2 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)：將FEF3按照1×104/孔鋪于96孔板中，10%胎牛血清穩(wěn)定24 h后，首次計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)分組：FEF3細(xì)胞株分別使用為KATOⅢ-CM、NUGC4-CM處理，并設(shè)置無血清組為對(duì)照組，每組8個(gè)復(fù)孔。每孔加入100 μ L CM。每24 h取出1組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，剩余更換CM。CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)按照說明書操作進(jìn)行。按照上述處理方案一共處理5 d，繪制增殖曲線。

1.2.3 SA-β-Gal染色：移除并沖洗待染色的成纖維細(xì)胞。固定液固定15 min。加入染色劑。37 ℃過夜。次日拍照。以上染色步驟均按照說明書操作進(jìn)行［5］。

1.2.4 雷帕霉素處理細(xì)胞：按照說明書配置工作液，處理細(xì)胞使用量為10 nmol，加入CM中與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)72 h后提取成纖維細(xì)胞蛋白，96 h后光鏡下染色觀察。

1.2.5 Western blotting：提取成纖維細(xì)胞系樣本總蛋白，根據(jù)蛋白濃度定量。配置蛋白上樣液，點(diǎn)樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，4 ℃過夜孵育一抗，37 ℃孵育二抗45 min，發(fā)光，抗體剝脫，封閉。GAPDH為內(nèi)參，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶的光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有結(jié)果均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CM處理后成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變

KATOⅢ-CM處理48 h后的FEF3、WI38細(xì)胞，出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡。FEF3-GFP熒光顯微鏡鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核固縮、細(xì)胞皺縮等特征性表現(xiàn)。見圖1。

圖1 KATOⅢ-CM處理48 h后成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變Fig.1 Morphological changes of fibroblasts treated with KATOⅢ-CM for 48 h

2.2 胃硬癌CM導(dǎo)致成纖維細(xì)胞死亡

使用KATOⅢ-CM和NUGC4-CM處理FEF3細(xì)胞后，CM培養(yǎng)下的成纖維細(xì)胞系出現(xiàn)死亡，隨著時(shí)間的推移，CM對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性逐漸增大，細(xì)胞死亡增多。而對(duì)照組基本維持一定水平。第2天開始，KATOⅢ-CM組和NUGC4-CM組細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見圖2。

2.3 CM抑制自噬的發(fā)生

圖2 不同CM處理組和對(duì)照組FEF3細(xì)胞的增殖曲線Fig.2 Proliferation activity curves of FEF3 cells in CM-treated and control groups

KATOⅢ-CM作用于FEF3和WI38細(xì)胞后，2種細(xì)胞中p62、LC3逐漸累積，而LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的誘導(dǎo)在FEF3和WI38中均未見明顯升高。說明CM處理后，成纖維細(xì)胞的自噬受到不同程度的抑制。除此之外，PARP表達(dá)上調(diào)，表明CM對(duì)成纖維細(xì)胞DNA有損傷，并引起凋亡增加。這與之前光鏡所見的形態(tài)學(xué)變化結(jié)果一致。此外，衰老相關(guān)的p21蛋白表達(dá)上調(diào)。見圖3A、3B。

2.4 細(xì)胞出現(xiàn)過早衰老

對(duì)KATOⅢ-CM和NUGC4-CM處理 96 h后的FEF3和WI38細(xì)胞進(jìn)行SA-β-Gal染色［6］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CM作用于成纖維細(xì)胞后，誘導(dǎo)了細(xì)胞的衰老。在CM作用條件下，大量細(xì)胞被染色。表明CM可以使成纖維細(xì)胞提前衰老。見圖4。

圖3 Western blotting檢測(cè)CM處理48 h后成纖維細(xì)胞蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expressions of proteins in fibroblasts treated with CM after 48 hours，detected using Western blotting

圖4 CM培養(yǎng)FEF3和WI38細(xì)胞96 h后SA-β-Gal 染色結(jié)果 ×100 Fig.4 SA-β-galactosidase staining of FEF3 and WI38 cells after cultivation with CM for 96 hours ×100

2.5 雷帕霉素抑制CM作用下成纖維細(xì)胞的衰老

雷帕霉素作為mTOR通路抑制劑，可以誘導(dǎo)自噬。使用雷帕霉素處理KATOⅢ-CM和NUGC4-CM作用下的FEF3和WI38細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素處理后的成纖維細(xì)胞，LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ的變化增加，p62輕微上調(diào)，表明自噬被激活。p21表達(dá)下調(diào)，SA-β-Gal染色變淺，衰老被抑制。見圖3 C、圖5。

圖5 雷帕霉素與CM培養(yǎng)FEF3和WI38細(xì)胞96 h后SA-β-Gal 染色結(jié)果 ×100Fig.5 SA-β-galactosidase staining of FEF3 and WI38 cells after cultivation with CM and rapamycin for 96 hours ×100

3 討論

腫瘤微環(huán)境是腫瘤賴以生存的組織環(huán)境，其中成纖維細(xì)胞是細(xì)胞外基質(zhì)中的重要細(xì)胞［7］。腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的過程中，成纖維細(xì)胞必須激活成為腫瘤成纖維細(xì)胞后才能為腫瘤的惡性行為提供幫助［8-9］。目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞可以分泌某些細(xì)胞因子，作用于周圍的組織細(xì)胞［10］。然而，具體作用機(jī)制仍不十分明了。

本研究使用胃硬癌CM對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理。研究發(fā)現(xiàn)，隨著作用時(shí)間的推移，細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞核固縮、細(xì)胞質(zhì)空泡化等特征性形態(tài)學(xué)改變。此外，CM對(duì)正常成纖維細(xì)胞的致死性存在時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。在該類胃癌患者病理組織中，腫瘤間質(zhì)中可見大量膠原蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)等成分，其中散在少量的異型成纖維細(xì)胞［11］。因此推斷，腫瘤細(xì)胞對(duì)周圍正常成纖維細(xì)胞產(chǎn)生毒性，促使成纖維細(xì)胞發(fā)生改變，從而適應(yīng)其腫瘤生物學(xué)需求。

當(dāng)機(jī)體或細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，自噬作為機(jī)體防御機(jī)制被加強(qiáng)，為細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境起到了重要作用［12］。本研究使用KATOⅢ-CM作用于2種不同種類的成纖維細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過CM處理后的成纖維細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的累積、自噬受到抑制。此外，DNA損傷相關(guān)的重要蛋白PARP在CM處理后表達(dá)上調(diào)，這證明CM通過減少自噬，導(dǎo)致部分成纖維細(xì)胞死亡。然而經(jīng)過CM處理后的成纖維細(xì)胞，除了部分凋亡，還有部分可以長期存活。而這些殘存的成纖維細(xì)胞與原始細(xì)胞形態(tài)學(xué)差別很大，表現(xiàn)出明顯的異型性。據(jù)此猜測(cè)，在體內(nèi)條件下，這些成纖維細(xì)胞通過胃硬癌細(xì)胞的作用可能也發(fā)生了類似的改變。

由于腫瘤的發(fā)生發(fā)展必須繞過衰老的發(fā)生［13］，然而衰老的成纖維細(xì)胞可以促進(jìn)腫瘤的生物學(xué)行為［14］。因此，本研究檢測(cè)了在CM作用下成纖維細(xì)胞的衰老情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在CM培養(yǎng)下成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老、形態(tài)學(xué)改變。在使用雷帕霉素與CM共同作用成纖維細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞的凋亡減少、自噬誘導(dǎo)、衰老被抑制。根據(jù)以上結(jié)果推測(cè)，胃硬癌細(xì)胞可能通過抑制自噬，從而促使成纖維細(xì)胞凋亡和過早衰老，衰老的成纖維細(xì)胞起到促進(jìn)腫瘤生物學(xué)行為的作用。成纖維細(xì)胞可能通過啟動(dòng)這樣的自我保護(hù)機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞對(duì)成纖維細(xì)胞的毒性作用降低，這可能是一種成纖維細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。但另一方面，這種機(jī)制可能使成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，反過來促進(jìn)胃硬癌的早期轉(zhuǎn)移［15］。

綜上所述，胃硬癌CM通過抑制成纖維細(xì)胞自噬，誘導(dǎo)其早期衰老。成纖維細(xì)胞可能通過這樣的方式轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞，并最終參與了該類胃癌的早期轉(zhuǎn)移。然而胃硬癌通過何種方式、分泌何種細(xì)胞因子進(jìn)入細(xì)胞基質(zhì)使得成纖維細(xì)胞發(fā)生這種改變，還有待深入研究。本研究結(jié)果顯示，胃硬癌細(xì)胞CM可以作用于成纖維細(xì)胞，使成纖維細(xì)胞凋亡增加、自噬阻斷、并誘導(dǎo)細(xì)胞的早期衰老。本研究結(jié)果為深入研究二者相互作用機(jī)制，提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。