解東洋 祝 琴 劉忠鈺 趙 慧 鄧永強葉 青 李曉峰 秦成峰1,**

(1. 安徽醫(yī)科大學，安徽合肥 230032； 2. 軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071； 3. 廣州醫(yī)科大學附屬廣州市第八人民醫(yī)院，廣東廣州 510182)

登革病毒(dengue virus, DENV)屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒。自然界中的登革病毒包括4個血清型(DENV1，DENV2，DENV3，DENV4)，均可引起溫和的登革熱(dengue fever, DF)以及嚴重的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome, DSS)(Screatonetal.，2015；Guzmanetal.，2016)。目前登革病毒感染所致疾病是世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最為嚴重的蚊媒病毒病，廣泛流行于全球100多個國家，全球每年因登革病毒感染死亡的人數(shù)約為2.5萬(Bhattetal.，2013)。在我國，登革1～4型病毒均有流行，流行區(qū)主要分布于廣東、廣西、云南、福建等南方省區(qū)。近年來，伴隨著全球氣候變暖等原因的發(fā)生，流行地區(qū)不斷擴大，浙江、山東等地不斷暴發(fā)輸入病例導(dǎo)致的登革熱本土流行(Lietal.，2018)。

登革疫苗的研發(fā)歷來受到重視，并取得重要進展。近些年，以黃病毒減毒疫苗株的基因組為骨架構(gòu)建嵌合病毒已成為研究登革病毒疫苗的一個新思路(Monathetal.，2015；Barrettetal.，2017)。其中賽諾菲巴斯德研發(fā)的以黃熱疫苗株17D為骨架的嵌合登革四價疫苗已經(jīng)獲批上市(Heneinetal.，2017)。以登革病毒減毒株DENV4Δ30為骨架的嵌合疫苗株已經(jīng)進入臨床Ⅲ期研究，顯示出巨大的發(fā)展前景(Pierceetal.，2017)。我國自主研制的乙腦減毒活疫苗 SA14-14-2 于1989年在中國被批準上市，已經(jīng)有超過3億兒童接種疫苗，該疫苗株具有良好的減毒特性和安全性，單次免疫能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生保護性的中和抗體，而且免疫力持久(Wangetal.，2014；Wijesingheetal.，2014)。我們以該疫苗株為骨架，先后構(gòu)建了登革2型病毒、寨卡病毒、西尼羅病毒等重組嵌合疫苗株，并完成了相應(yīng)臨床前研究(Lietal.，2013；Lietal.，2013；Wangetal.，2016； Wangetal.，2016；Lietal.，2018)。本研究中，我們以乙腦減毒活疫苗株SA14-14-2基因組為骨架，成功構(gòu)建了嵌合登革4型疫苗侯選株(ChinDENV4)，并對其生物學性質(zhì)進行了評價，為新型登革病毒疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要細胞、病毒和載體：大腸桿菌 MC1061 感受態(tài)細胞、金黃地鼠腎細胞BHK-21、蚊C6/36細胞系由軍事科學院軍事醫(yī)學研究院微生物流行病研究所病毒學研究室細胞庫保存。DENV4-GZ30病毒株(GenBank號：JQ822247)由本室分離自中國廣州并保存。乙腦病毒全長感染性克隆質(zhì)粒pAJE70由本室構(gòu)建保存(Yeetal.，2012)，乙腦減毒活疫苗株 SA14-14-2 由成都生物制品研究所提供。

1.1.2主要試劑：Pure LinkTMRNA Mini Kit、Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司，One Step Primescript RT-PCR kit、M-MLV reverse transcription polymerase、XhoⅠ、KasⅠ、BspEⅠ、SacⅡ、NruⅠ購自Takara公司，Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、T4 DNA Ligase購自Promega公司，Alexa Fluor 488 標記山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋公司。

1.2 引物

利用Primer 6.0軟件，根據(jù)GenBank中DENV4-GZ30病毒株序列及日本腦炎病毒ORF設(shè)計引物，并在其兩端引入酶切位點KasⅠ和BspEⅠ(引物序列斜體堿基為酶切位點)， PCR引物見下表1。

1.3 嵌合病毒全長感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建嵌合病毒(ChinDENV4)時，去除了DENV4 prM/E基因序列中存在的酶切位點BspEⅠ，并在目標基因兩端引入酶切位點KasⅠ、BspEⅠ，使得目的片段和骨架能被雙酶切。將DENV4-GZ30病毒株RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為模板，以相應(yīng)引物擴增片段D4-AE和D4-BF；以pAJE70作為模板，擴增片段D4-CD。利用融合PCR的方法將擴增所得3個片段融合成片段D4-AD。使用KasⅠ和BspEⅠ分別對pAJE70和D4-AD進行雙酶切，對回收雙酶切后所得目的片段用T4連接酶4℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MC1061感受態(tài)細胞中，然后挑選菌落鑒定。最后，使用酶SacⅡ和NruⅠ對嵌合克隆質(zhì)粒進行酶切鑒定。

表1 實驗所用引物

Restriction enzyme sites incorporated into primers are marked in italic.

1.4 體外轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)染實驗

克隆質(zhì)粒pChinDENV4經(jīng)線性化并純化后，使用Sp6體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，對其進行體外轉(zhuǎn)錄。將所得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入6孔板培養(yǎng)至長滿 70%～80% 的BHK-21細胞內(nèi)，置于37℃ CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞狀態(tài)，查看細胞是否產(chǎn)生病變。

1.5 蝕斑形成實驗

用細胞維持液將病毒液10倍倍比稀釋；在單層致密的12孔細胞培養(yǎng)板中，加入500 μL不同稀釋度的病毒懸液，37℃ 5% CO2孵箱內(nèi)孵育1 h；棄去病毒液，每孔加入1 mL的含1%低熔點瓊脂糖的DMEM培養(yǎng)基，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，每天按時觀察；當細胞出現(xiàn)明顯的病變現(xiàn)象時，取出細胞培養(yǎng)板，每孔加入1 mL的4%甲醛固定液，室溫固定1 h，棄去固定液和瓊蓋，清水沖洗殘余液；每孔加入1.5%結(jié)晶紫溶液500 μL，室溫染色10 min，棄去結(jié)晶紫染液并用大量清水沖洗，待晾干計數(shù)出斑數(shù)并拍照。

1.6 間接免疫熒光實驗

將細胞傳至鋪有玻璃片的24孔板中，在37℃ 5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)24 h至細胞長滿70%左右；按照MOI=0.01稀釋病毒并將病毒液接種于細胞中，37℃孵育1 h后，吸出原病毒液，換成病毒維持液，繼續(xù)在孵箱中培養(yǎng)至72 h；取出玻璃片，放入丙酮玻璃盒內(nèi)-20℃固定30 min，取出晾干后置于-20℃保存?zhèn)溆谩０?∶500 稀釋實驗所用一抗(MAb 2B8和JN1)，每孔200 μL加在玻璃片上，37℃孵育1 h，取出后清洗3次；使按1∶300稀釋Alexa Flour 488標記羊抗鼠IgG二抗，每孔200 μL加在玻璃片上，37℃孵育1 h，取出后清洗3次；加入DAPI核染液，每孔加200 μL，室溫孵育5 min；使用熒光顯微鏡進行拍攝，觀察實驗熒光結(jié)果。

1.7 生長曲線測定實驗

傳細胞至24孔板中，每孔加入500 μL細胞懸液；將細胞培養(yǎng)板置于37℃5% CO2恒溫孵箱中至細胞長滿80%左右；按照MOI=0.1用病毒維持液稀釋病毒；每孔加入200 μL病毒稀釋液，在恒溫培養(yǎng)箱孵育1 h；棄去病毒液，加入病毒維持液繼續(xù)培養(yǎng)，不同時間點取細胞上清液，用蝕斑法測定病毒滴度，繪制病毒生長曲線。

1.8 乳鼠神經(jīng)毒力實驗

將ChinDENV4病毒株和DENV4-GZ30病毒株，分別稀釋至濃度為100、1000、10000和100000 PFU/mL，每組注射至一窩1日齡BALB/c乳鼠(10～11只)，每只乳鼠注射20 μL，每天定時觀察乳鼠死亡情況，并繪制顱內(nèi)接種小鼠的生存曲線圖。

2 結(jié)果

2.1 嵌合病毒基因組全長cDNA感染性克隆的構(gòu)建

按照構(gòu)建策略(圖1)，首先通過融合PCR方法獲得了目的片段D4-AD；進一步對目的片段D4-AD和SA14-14-2感染性克隆質(zhì)粒(pAJE70)進行雙酶切，并對純化后的酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接，最終獲得了攜帶有DENV4-prM/E的重組質(zhì)粒pChinDENV4。

圖1 嵌合病毒(ChinDENV4)的構(gòu)建策略圖Fig.1 Schematic diagram of ChinDENV4

使用SacⅡ和NruⅠ對pChinDENV4酶切，SacⅡ酶切后片段大小為10 927和2 624 bp，NruⅠ酶切后片段大小為7 385和6 166 bp。凝膠電泳鑒定顯示(圖2)，酶切后片段大小正確，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pChinDENV4。

2.2 嵌合病毒的拯救與鑒定

為拯救獲得嵌合病毒，把pChinDENV4的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、SA14-14-2病毒株核酸、DENV4-GZ30病毒株核酸分別轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，孵育72 h后，與對照組細胞狀態(tài)進行比較?？梢娹D(zhuǎn)染組均出現(xiàn)細胞聚集、圓縮、成團出現(xiàn)空泡樣變化并發(fā)生脫落，致使細胞出現(xiàn)典型病變現(xiàn)象(圖3-A)。提取被嵌合病毒感染的細胞培養(yǎng)上清液總RNA，以F8和R8作為上下游引物，通過 RT-PCR方法擴增出病毒基因組目的片段，擴增片段大小為800 bp，電泳結(jié)果顯示擴增片段正確，測序結(jié)果同時顯示，擴增所得片段為病毒特異序列。上述實驗結(jié)果表明成功獲得了嵌合病毒ChinDENV4。

圖2 融合片段和嵌合質(zhì)粒酶切鑒定Fig.2 Identification by restriction enzyme digestionA．融合片段D4-AD和pAJE70雙酶切純化后片段鑒定. M1：DNA marker DL15000；1：pAJE70質(zhì)粒雙酶切回收鑒定；2：融合PCR產(chǎn)物雙酶切回收鑒定; M2：DNA marker DL10000。B. 嵌合質(zhì)粒酶切鑒定. 3：pChinDENV4的SacⅡ酶切鑒定；4：pChinDENV4的NruⅠ酶切鑒定：M3：DNA marker DL10000。A: Restriction enzyme digestion of overlapping PCR product D4-AD and pAJE70. 1: pAJE70 digested by KasⅠand BspEⅠ; 2: Overlapping PCR product digested by KasⅠand BspEⅠ; M1: DNA marker DL15000; M2: DNA marker DL10000. B: Identification of the pChinDENV4 by restriction enzyme digestion. M3: DNA marker DL10000；3: pChinDENV4 digested by SacⅡ; 4: pChinDENV4 digested by NruⅠ.

圖3 乙腦登革嵌合病毒在BHK-21細胞上引起的細胞病變及病毒鑒定Fig.3 Identification of Chimeric virusA．乙腦登革嵌合病毒在BHK-21細胞上引起的細胞病變; B. 恢復(fù)病毒的RT-PCR鑒定.1: RT-PCR擴增的病毒特異序列片段；M: DNA marker DL10000。A: Chimeric virus induced CPE in BHK-21 cells. B: Identification of the chimeric virus by RT-PCR. 1: DNA fragments derived from RT-PCR with primer pairs F8/ R8; M: DNA marker DL10000.

2.3 ChinDENV4的蝕斑形態(tài)鑒定

將拯救的嵌合病毒株與其親本病毒株SA14-14-2和DENV4-GZ30在BHK-21細胞上的蝕斑形態(tài)進行了比較，結(jié)果顯示(圖4)，嵌合病毒株同樣能夠在 BHK-21 細胞上形成形態(tài)清晰、大小均一的蝕斑。并且與親本病毒株形成的蝕斑形態(tài)相比，嵌合病毒蝕斑直徑小于SA14-14-2株，而大于DENV4-GZ30株。

圖4 嵌合病毒ChinDENV4與其親本病毒株在BHK-21細胞上的蝕斑形態(tài)Fig.4 Plaque morphologies of ChinDENV4，SA14-14-2 and DENV4-GZ30 in BHK-21 cells

2.4 ChinDENV4的特異病毒蛋白分析

為了分析嵌合病毒在感染細胞中的病毒特異蛋白表達情況，用間接免疫熒光法對ChinDENV4、SA14-14-2和DENV4-GZ30感染72 h后的BHK-21 細胞的病毒蛋白進行鑒定，MOI=0.01。以登革4型 E 蛋白單克隆抗體MAb 2B8、乙腦NS1蛋白的 JN1為一抗，Alexa Fluor 488標記山羊抗小鼠作為二抗。結(jié)果顯示(圖5)，親本株SA14-14-2只能表達乙腦NS1蛋白，DENV4-GZ30只能表達登革E蛋白，而嵌合病毒株ChinDENV4能夠同時表達登革E蛋白和乙腦NS1蛋白。

2.5 ChinDENV4和親本株在不同細胞系中生長特性鑒定

按照MOI=0.1，將嵌合病毒株ChinDENV4和親本病毒株SA14-14-2、DENV4-GZ30接種于BHK-21和C6/36細胞，在24、48、72、96 h分別收集細胞上清，使用空斑法測定各時間點細胞上清病毒滴度。實驗結(jié)果表明(圖6)，ChinDENV4感染細胞48 h后病毒滴度達到峰值，分別為1.26×105和1.58×106PFU/mL，在BHK-21細胞上復(fù)制趨勢與親本株相似，在C6/36細胞上則比親本株復(fù)制較快，提前達到峰值。

圖5 嵌合病毒與其親本病毒的間接免疫熒光鑒定Fig.5 Indirect fluorescence assay of ChinDENV4，SA14-14-2 and DENV4 virus recovery in BHK-21 cells

圖6 嵌合病毒與親本株在BHK-21、C6/36細胞上的生長曲線Fig.6 Growth curves of ChinDENV4， SA14-14-2 and DENV4-GZ30 in BHK-21 and C6/36 cells

2.6 ChinDENV4的乳鼠神經(jīng)毒力評價

將相同劑量的ChinDENV4和DENV4-GZ30采用乳鼠顱內(nèi)接種法對嵌合感染1日齡BALB/c乳鼠，觀察并記錄小鼠存活情況，評價ChinDENV4的乳鼠神經(jīng)毒力。結(jié)果顯示(表2)，ChinDENV4的 LD50為6.32 PFU，而其親本病毒DENV4-GZ30的 LD50為2.94 PFU，降低2倍以上，表明ChinDENV4神經(jīng)毒力弱于DENV4-GZ30病毒株，具有減毒效果。

表 2 ChinDENV4 與其親本病毒的乳鼠神經(jīng)毒力Tab.2 Neurovirulence of ChinDENV4 and its parental viruses in suckling mice

3 討論

SA14-14-2作為乙型腦炎病毒的減毒活疫苗，已經(jīng)在中國、印度以及東南亞部分國家和地區(qū)接種使用，并且已經(jīng)獲得了世界衛(wèi)生組織的認可并推薦使用。SA14-14-2的原型株為SA14，在俞永新教授帶領(lǐng)下，其研究團隊將SA14在原代地鼠腎細胞以及鼠腦中多次傳代后，并通過噬斑分離得到(Eckelsetal.，1988)。與親本病毒SA14相比，SA14-14-2的神經(jīng)毒力以及神經(jīng)侵襲力顯著減弱，并具有很好的免疫原性，能提供長期有效的免疫保護(Yangetal.，2014)。

鑒于此，我們嘗試以乙腦減毒活疫苗SA14-14-2為骨架通過反向遺傳學技術(shù)成功構(gòu)建了乙腦嵌合登革4型病毒，并對其蝕斑形態(tài)、生長曲線、特異蛋白表達與神經(jīng)毒力進行了的評價。研究結(jié)果顯示嵌合病毒的蝕斑直徑小于乙腦減毒活疫苗株而與登革病毒之間差異小；在BHK-21和C6/36細胞中可有效復(fù)制，其乳鼠神經(jīng)毒力也弱于親本病毒。此外，我們選取的prM/E供體源自我國登革分離株，拯救獲得的嵌合登革病毒有望刺激產(chǎn)生更有效的免疫保護效力。

理想的登革疫苗是能產(chǎn)生針對四種型別登革病毒感染的保護，而不會出現(xiàn)ADE現(xiàn)象。因此新型登革疫苗應(yīng)為四價疫苗。此前，本實驗室已經(jīng)成功構(gòu)建乙腦/登革2型嵌合疫苗候選株，并在小鼠及恒河猴模型中對病毒攻擊具有良好的保護效果(Lietal.，2013)，而本研究中我們構(gòu)建了登革4型嵌合減毒疫苗株，并對其生物學特性進行了充分的鑒定，在此基礎(chǔ)上，我們將進一步建立登革病毒1、3型嵌合疫苗株，從而為新一代登革四價疫苗的研制奠定關(guān)鍵的技術(shù)基礎(chǔ)。