王 威，朱慶麗，朱殿雨 ，李倚云*

(1.揚州市食品藥品檢驗檢測中心，揚州 225009； 2.揚州寶應縣中醫(yī)醫(yī)院，揚州 225800)

接骨續(xù)筋丸具有和營活血、接骨續(xù)筋作用，用于跌打損傷所致軟組織損傷、骨折脫位中后期筋肉攣痛見上述癥候者，是臨床使用近10年的一種醫(yī)院中藥制劑，主要由紅花、血竭、麝香、骨碎補等15味藥材炮制而成。方中紅花、血竭[1，2]具有活血行滯、化瘀生新作用為君藥；麝香、丁香[3，4]有補腎助陽、活血通經作用為臣藥；骨碎補、自然銅[5，6]等具接骨續(xù)斷作用，全方合用可續(xù)筋接骨、消腫止痛。微生物限度檢查是考查口服固體制劑療效及安全性的一個重要項目。為了保證該制劑的使用安全性，真實反映該制劑的微生物污染狀況，根據《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107[7]的規(guī)定及要求，進行方法適用性試驗，建立微生物限度檢查法。

接骨續(xù)筋丸為含有藥材原粉的中藥制劑，根據《中國藥典》通則1107，微生物限度檢查包括需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數計數和控制菌(大腸埃希菌、沙門菌和耐膽鹽革蘭陰性菌)檢查。需氧菌總數計數、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗要求試驗菌的菌數回收率在0.5～2，控制菌檢查要求陽性對照組中檢出相應的對照菌[7]。在建立檢查方法過程中，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)上其他類型菌落的生長造成霉菌和酵母菌總數超出限度規(guī)定，干擾了結果判斷，本文同時就此情況進行試驗研究，建立更合理的檢查法，真實反映該制劑的微生物染菌程度，有助于切實掌握該醫(yī)院制劑質量，把控好制劑生產環(huán)節(jié)，為患者及時提供合格產品。

1 材料及儀器

1.1儀器 SZ-201凈化工作臺(安徽蚌埠凈化設備廠)、BHC-850生物安全柜(吳江市凈化設備總廠)、GR85DA高壓蒸汽滅菌器[致微(廈門)儀器有限公司]、SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱和MJX-250B-Z霉菌培養(yǎng)箱(上海博訊實業(yè)有限公司)、HKG-9220A電熱恒溫干燥箱(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、SE602F電子天平(奧豪斯儀器有限公司)、XSP-BM-2C生物顯微鏡(上海彼愛姆光學儀器制造有限公司)。

1.2供試品 接骨續(xù)筋丸(規(guī)格：45 g/瓶，揚州寶應縣中醫(yī)醫(yī)院，批號170612、170626、170701)。

1.3試驗用菌株 金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candidaalbican)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003]、大腸埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、乙型副傷寒沙門菌(SalmonellaparatyphiB)[CMCC(B)50094]均來源于中國食品藥品檢定研究院。

1.4培養(yǎng)基及試劑 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，批號20161206)、SDA(批號20150923)、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號20160719)、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基(SDB，批號20150722)、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(批號20150819)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基(批號20150715)、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基(TSI，批號20150917)、pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液(批號20160723)均由青島海博生物技術有限公司提供；麥康凱液體培養(yǎng)基(批號20151109)、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基(MUG，批號20160501)、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(批號20151106)、RV沙門增菌液體培養(yǎng)基(批號20151101)、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(XLD，批號20160501)均由北京牛?；蚣夹g有限公司提供；硫酸慶大霉素注射液[規(guī)格：2 ml∶80 mg(8萬單位)，批號3170609]，由福安藥業(yè)集團煙臺只楚藥業(yè)有限公司提供。SDA對照培養(yǎng)基(SDARM，批號135013-201502)，來源于中國食品藥品檢定研究院，由江蘇省康華醫(yī)藥科技實業(yè)中心提供；0.9%無菌氯化鈉溶液及革蘭氏染色試液為實驗室自配。

2 方法與結果

參照《中國藥典》2015年版四部通則1105、1106、1107微生物限度檢查方法適用性試驗要求，建立檢查法。

2.1菌液制備 取經35 ℃培養(yǎng)24 h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、沙門菌新鮮TSB培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為小于104cfu/ml(計數方法適用性)或小于100 cfu/ml(控制菌檢查方法適用性)的菌懸液。取經25 ℃培養(yǎng)48 h的白色念珠菌新鮮SDB培養(yǎng)物，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋為小于104cfu/ml的菌懸液。取經25 ℃培養(yǎng)7 d的黑曲霉改良馬丁斜面培養(yǎng)物，加適量含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液洗下孢子，并稀釋為小于104cfu/ml的孢子懸液。

2.2供試液制備 取供試品10 g，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，勻漿儀3 000 r/min處理30 s，使分散均勻，作為1∶10供試液，取1∶10供試液10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液至100 ml，作為1∶100供試液。取供試品10 g，加TSB至100 ml，充分振搖使分散均勻，作為耐膽鹽革蘭陰性菌檢查初步增菌液；另取供試品10 g，研磨后接種至200 ml TSB中，作為沙門菌檢查初步增菌培養(yǎng)液。

2.3需氧菌總數計數方法適用性試驗 接骨續(xù)筋丸中無明顯抑菌成分，初步采用傾注平皿法(1 ml/皿)，使用TSA對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉為需氧菌總數計數代表菌進行回收試驗。

2.3.1試驗組 取1∶100供試液50 ml 5份，分別加入各試驗菌懸液0.5 ml，混勻。分別取各組試液1 ml，置90 mm無菌平皿中，注入15～20 ml溫度不超過45 ℃熔化的TSA，混勻，凝固，35 ℃倒置培養(yǎng)，作為需氧菌總數計數試驗組。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌培養(yǎng)3 d，白色念珠菌和黑曲霉培養(yǎng)5 d。每組平行操作2平皿。

2.3.2供試品對照組 取1∶100供試液50 ml，加入pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液0.5 ml，混勻。不加各試驗菌，操作同“2.3.1”，計數菌落數。

2.3.3菌液對照組 取pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液50 ml 5份，分別加入各試驗菌懸液0.5 ml，混勻。操作同“2.3.1”，計數菌落數。試驗菌菌數回收率=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液組平均菌落數。

2.3.4試驗結果 由表1可知，各試驗菌菌數回收率均在0.5～2范圍內，所采用的方法適用于該制劑的需氧菌總數計數檢查。

2.4霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗

2.4.1試驗方法Ⅰ 取1∶10供試液，采用傾注平皿法(1 ml/皿)，使用SDA，以黑曲霉、白色念珠菌為霉菌和酵母菌為代表菌進行回收試驗。試驗操作同“2.3.1”～“2.3.3”，25 ℃倒置培養(yǎng)5 d，分別計數，試驗結果見表2。

2.4.2試驗方法Ⅱ 取1∶10供試液，采用含慶大霉素的SDA，抑制供試品中細菌的生長，對霉菌和酵母菌總數計數重新進行方法適用性試驗，試驗操作同“2.4.1”。SDA在臨用前，加入慶大霉素濃度為5 000 U/L。另外使用SDARM，對菌液對照組進行菌落計數。試驗結果見表3。

2.4.3試驗結果 由表2和表3可以看出，方法Ⅰ和Ⅱ試驗組2株試驗菌菌數回收率均在0.5～2，符合方法適用性試驗要求。但根據《中國藥典》四部通則1107限度標準，供試品霉菌和酵母菌總數限度為102cfu/g，方法Ⅰ結果3個批號的供試品霉菌和酵母菌總數分別為420、490和380 cfu/g，均超過此限度，樣品該項目不符合要求。由表3可以看出，含有慶大霉素的SDA均有效抑制了供試品中的非霉菌和酵母菌的生長繁殖，使供試品對照組的“霉菌和酵母菌總數”明顯減少，排除了干擾。對“2.4.1”中供試品對照組的菌落進行形態(tài)和革蘭氏染色觀察，基本屬于細菌，使用含慶大霉素5 000 U/L的濃度的SDA可有效抑制細菌的生長。另外含有慶大霉素的SDA對于霉菌和酵母菌的促生長能力與SDARM比較無差異，符合培養(yǎng)基適用性檢查要求[7]。

表1 需氧菌總數計數方法適用性試驗結果

表2 霉菌及酵母菌總數計數試驗方法Ⅰ結果

表3 霉菌和酵母菌總數計數試驗方法Ⅱ結果

2.5控制菌檢查適用性試驗

2.5.1大腸埃希菌 取1∶10供試液10 ml，接種至100 ml TSB中，加入大腸埃希菌菌懸液1 ml作為大腸埃希菌檢查陽性對照組；同法操作不加入陽性菌，作為供試品組；同時取pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液10 ml接種至100 ml TSB中，作為陰性對照組。取上述各組，按《中國藥典》規(guī)定的過程，分別進行增菌培養(yǎng)、麥康凱液體培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板選擇和分離培養(yǎng)。結果陽性對照組中檢出大腸埃希菌。

2.5.2耐膽鹽革蘭陰性菌 取“2.2”項下的耐膽鹽革蘭陰性菌檢查初步增菌培養(yǎng)液3份，1份加入大腸埃希菌菌懸液1 ml、1份加入銅綠假單胞菌菌懸液1 ml作為陽性對照組，1份作為供試品組；同時取TSB 200 ml作為陰性對照組，按《中國藥典》規(guī)定的過程，分別進行增菌培養(yǎng)、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基和紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板選擇和分離培養(yǎng)。結果陽性對照組中檢出以大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為代表的耐膽鹽革蘭陰性菌。

2.5.3沙門菌 取“2.2”項下的沙門菌檢查初步增菌培養(yǎng)液2份，1份加入沙門菌菌懸液1 ml作為陽性對照組，另一份作為供試品組；同時取TSB 200 ml作為陰性對照組，按《中國藥典》規(guī)定的過程，分別進行增菌培養(yǎng)、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基和XLD平板選擇和分離培養(yǎng)。結果陽性對照組中檢出沙門菌。

3 討論

3.1接骨續(xù)筋丸微生物計數采用傾注平皿法(1 ml/皿)，需氧菌總數計數的5株菌株及使用含慶大霉素(5 000 U/L)的SDA進行霉菌及酵母菌總數計數的2株菌株的菌數回收率均在0.5～2之間，控制菌檢查采用的方法在陽性對照組中檢出了大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌，所建立的方法適用于該制劑的微生物限度檢查。

3.2《中國藥典》2015年版微生物限度檢查中計數法的適用范圍較舊版發(fā)生了變化[8]，TSA和SDA提升了微生物的促生長能力，擴大了計數微生物的類型和范圍[9，10]，供試品的霉菌和酵母菌總數為SDA上生長的總菌落。接骨續(xù)筋丸的霉菌和酵母菌總數計數采用“2.4.1”項下方法，方法符合適用性試驗要求，因非目的菌的生長導致超出限度標準，制劑的產品質量“不合格”。在本次研究中，重新建立微生物限度檢查法，使用添加適量慶大霉素的SDA，抑制了非目的菌的生長，體現(xiàn)產品霉菌和酵母菌的真實污染狀況，避免了假陽性結果。

3.3非無菌口服固體制劑在微生物限度檢查中，同樣存在非目的菌的生長致使霉菌和酵母菌總數不符合限度標準的情況，尤其是含藥材原粉的片劑、膠囊、丸劑[11]等中成藥，因為原輔料、生產及炮制工藝、包裝、儲藏和給藥途徑等原因，這些制劑允許高濃度的需氧菌存在，一般都在104cfu/g以上，其容易在普通SDA上生長，造成霉菌和酵母菌總數超出限度。使用添加適量抗生素如慶大霉素、氯霉素等SDA[12]或其他選擇性培養(yǎng)基建立檢查方法，可以反映產品真實的霉菌和酵母菌污染狀況，避免假陽性結果。本次試驗研究結合工作實際，為處理此類假陽性情況提供思路。