解 慧

(天津市藥品檢驗研究院，天津 300070)

實驗室數(shù)據(jù)可靠性和有效性是檢驗工作和科學(xué)研究的生命線。利用微生物標準菌株進行檢驗方法學(xué)驗證試驗越來越受到重視，繼《中國藥典》要求進行微生物檢驗方法適用性試驗后，保健食品和化妝品風(fēng)險監(jiān)測工作中也提出相關(guān)要求。利用標準菌種作為參考標準物質(zhì)，進行藥品、保健食品和化妝品微生物檢驗過程控制，是保障檢驗結(jié)果科學(xué)準確的重要環(huán)節(jié)，《中國藥典》、保健食品和化妝品風(fēng)險監(jiān)測工作手冊等均有明確要求[1-3]。微生物檢驗方法學(xué)適用性試驗需要用到一定數(shù)目的標準菌株，傳統(tǒng)的梯度稀釋方法操作繁瑣，工作量較大。目前，市售國內(nèi)外質(zhì)控菌株類型較少，多使用ATCC菌株或《中國藥典》常用菌株，且價格昂貴，使檢驗成本提高。微生物定量質(zhì)控菌株是考查實驗室檢驗結(jié)果準確、可靠的重要工具，適用于食品、藥品微生物檢測的定量質(zhì)控菌株是制約微生物檢驗標準化的一個瓶頸。

本研究通過優(yōu)化培養(yǎng)條件和流程，制備金黃色葡萄球菌定量質(zhì)控菌株，并對其均勻性、穩(wěn)定性和保存條件進行考查，證明其能滿足質(zhì)控樣品使用的要求，可以用于日常檢驗工作中的陽性對照試驗和微生物限度檢查方法學(xué)適用性試驗，還可用于實驗室內(nèi)質(zhì)量控制比對試驗。

1 儀器與試藥

1.1儀器 生物安全柜(BAKER SG-403A TX-INT)，天平(sartorius TE612-L)，恒溫培養(yǎng)箱(BINDER KB720)，恒溫搖床(Thermo MaxQ 4000)，冷凍干燥機(HETO POWER DRY LL1500)，低速自動平衡離心機(Eppendof Centrifuge 5702)，冰箱(Hair BCD-268DA)，低溫冰箱(Froilabo Congelateur)。

1.2試藥D-海藻糖(Solarbio，批號411B054)，脫脂奶粉(Solarbio，批號408B0513)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，北京陸橋有限責(zé)任公司，批號151027)，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA，北京陸橋有限責(zé)任公司，批號151202)，磷酸鹽緩沖液 PBS(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號20140822)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B) 26 003] 購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1金黃色葡萄球菌的生長曲線測定 將甘油管保存的菌株接種至10 ml TSB培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)18 h，使菌株充分復(fù)蘇。吸取0.1 ml培養(yǎng)物接種于新鮮的10 ml TSB培養(yǎng)基中，36 ℃培養(yǎng)過夜，作為種子液。吸取1 ml種子液接種于新鮮的100 ml TSB培養(yǎng)基中，36 ℃、180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h，無菌條件下吸取5 ml培養(yǎng)液，于600 nm處測定吸光度，繪制金黃色葡萄球菌的生長曲線。

2.2金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株的制備流程 按“2.1”步驟制備金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物，4 400 r/min離心5 min，傾倒上清，PBS清洗一次，4 400 r/min再次離心5 min獲得菌體。采用5%脫脂奶粉+5%海藻糖作為保護劑[4]，使菌體充分懸浮混勻。分裝至西林瓶中，-20 ℃預(yù)凍4 h，使混懸液冷凍凝結(jié)。放入真空冷凍干燥機，待樣品充分干燥后取出。將透氣棉塞更換為無菌橡膠塞，密封冷藏。以此方法制成106cfu含菌量和104cfu含菌量的樣本，冷凍干燥后保存。

2.3離心和清洗損失率的測定 取種子液1 ml接種于新鮮的100 ml TSB培養(yǎng)基中，于搖床中180 r/min、36 ℃培養(yǎng)4 h，此時的混懸液作為樣品1。取部分上述培養(yǎng)物4 400 r/min離心5 min，傾倒上清，PBS清洗一次，4 400 r/min再次離心5 min獲得菌體。采用5%脫脂奶粉+5%海藻糖作為保護劑[4]，使菌體充分懸浮混勻，此時的混懸液作為樣品2。對樣品1和樣品2分別進行梯度稀釋，測定活菌數(shù)，分別記為A和B。則計算公式為：離心和清洗損失率=(1-B/A)×100%。

2.4冷凍干燥損失率的測定 待樣品在冷凍干燥機凍干后，取出，立刻取其中一瓶作為樣品3。梯度稀釋后，測定活菌數(shù)，記為C。則計算公式為：冷凍干燥損失率=(1-C/B)×100%。

2.5金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品的均一性驗證 106cfu 含菌量樣本均一性驗證：隨機抽取106cfu組質(zhì)控樣品10瓶，每瓶加入1 ml 生理鹽水，將金黃色葡萄球菌凍干物充分溶解，吸取0.1 ml進行適當梯度稀釋后，取1 ml于平皿中，傾注TSA培養(yǎng)基，置36 ℃培養(yǎng)18～24 h。進行菌落計數(shù)。同法進行104cfu組質(zhì)控樣品計數(shù)。

2.6儲藏條件的驗證 將制備的106cfu和104cfu金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品分別保存于4 ℃、-20 ℃和-80 ℃。于0～90 d及1年分別取出金黃色葡萄球菌質(zhì)控樣品進行菌落計數(shù)，觀察復(fù)蘇率的變化，考查貯藏穩(wěn)定性。

其中R為復(fù)現(xiàn)性限，r為重復(fù)性限，n為檢測值的數(shù)量。

2.8定量質(zhì)控菌株的活力檢測 參照《中國藥典》2015版四部通則1105非無菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計數(shù)法，選擇8種藥品，分別采用-80 ℃保存的106cfu樣品和正常制備工作菌株，進行回收率測定。所采用藥品各取10 g，分別加pH 7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 ml，混勻，作為1∶10供試液。具體實驗方法如下。

2.8.1吲達帕胺滴丸 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<100 cfu/ml的供試液，取1 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.2脈管康復(fù)片 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<1 000 cfu/ml的供試液，取0.1 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.3生脈飲/鹽酸二甲雙胍片 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<2 000 cfu/ml的供試液，取0.5 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.4厄貝沙坦氫氯噻嗪分散片/醒腦安神膠囊 取1∶10供試液9.9 ml，加入適量濃度的0.1 ml金黃色葡萄球菌菌液，制成菌含量<5 000 cfu/ml的供試液，取0.2 ml至平皿中，立即傾注TSA。

2.8.5清咽滴丸 取1∶10供試液0.2 ml用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100 ml稀釋后，全量薄膜過濾，用500 ml pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液分次沖洗5次，在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)后薄膜過濾，取膜貼于TSA上，依法檢查。

2.8.6鹽酸沙格雷酯片 將1∶10供試液全量置于帶過濾功能均質(zhì)器專用袋(上新牌，規(guī)格30 cm×19 cm)大體積一側(cè)中，在拍打儀中充分拍打30 s。取粗濾后小體積一側(cè)的1∶10供試液0.2 ml薄膜過濾，用pH 7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液500 ml分次沖洗，并在最后一次沖洗液中加入規(guī)定量試驗菌(不大于100 cfu)，取膜貼于TSA上，依法檢查。

3 結(jié)果

3.1金黃色葡萄球菌生長曲線 把少量微生物接種到一定體積的新鮮培養(yǎng)基后，在適宜的溫度、通氣等條件下，微生物就會從小到大，數(shù)目增多，表現(xiàn)出有規(guī)律的生長，根據(jù)其生長速率常數(shù)可以得出生長曲線。典型的微生物生長曲線包括延滯期、指數(shù)期(對數(shù)期)、穩(wěn)定期和衰亡期。通過定時取樣，測定600 nm處的吸光度發(fā)現(xiàn)，按1%接種量，180 r/min、36 ℃培養(yǎng)條件下，金黃色葡萄球菌在2 h左右進入對數(shù)期，6 h后進入穩(wěn)定期，此時菌體數(shù)目約為1.0×109cfu(如圖1)。指數(shù)期的微生物代謝活躍，生長迅速，生理特性較一致，各細胞成分平衡增長，因而是代謝、生理研究的好材料。因此采用1%接種量，180 r/min、36 ℃培養(yǎng)4 h，制備金黃色葡萄球菌菌體。

圖1 金黃色葡萄球菌的生長曲線

3.2定量質(zhì)控菌株的制備 保護劑可以減少冷凍干燥引起的微生物細胞損傷。常見的保護劑包括葡萄糖、谷氨酸等中性或酸性化合物，明膠和藻類等高分子物質(zhì)及分解物，脫脂乳及血清等天然混合物，及抗壞血酸和羥胺等[6]。脫脂奶粉的主要成分是蛋白質(zhì)和糖類，其中蛋白質(zhì)的直徑在1～2 nm之間，溶于水中形成膠體溶液，蛋白質(zhì)分子比細菌小得多，在菌體外形成蛋白膜，對細胞加以保護，并可固定凍干酶類，防止由于細胞壁蛋白質(zhì)損壞而引起的胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，而且脫脂奶粉中其他成分(如乳糖等) 同樣可提高菌體的凍干存活率。海藻糖具有特殊的水合作用，能夠穩(wěn)定細胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，抗逆保鮮，在冷凍干燥生物制品方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究使用5%脫脂奶粉和5%海藻糖作為保護劑，制成106cfu含菌量、104cfu含菌量的凍存管，凍存菌體經(jīng)活化證明均保持了較好的活性。離心和清洗過程對菌體細胞的損失率較大，約為95%。冷凍干燥過程同樣造成菌體細胞的減少，損失率約為37%。

3.3質(zhì)控樣品的均一性檢測 復(fù)現(xiàn)性臨界差值(CD)=0.38(R取0.45，r取0.25，n取10)[5]。106cfu組10瓶樣品均一性檢測結(jié)果如表1顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為4.6×106cfu，那么控制范圍為1.9×106～1.1×106cfu。本實驗10組數(shù)據(jù)均在上述范圍內(nèi)，質(zhì)控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。104cfu組10瓶樣品均一性檢測結(jié)果如表1顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為5.5×104cfu，則控制范圍為1.3 ×105～2.2×104cfu，本實驗所有數(shù)據(jù)均在上述范圍內(nèi)，質(zhì)控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。

表1 質(zhì)控樣品的均一性檢測 cfu

3.4儲存條件檢測 106cfu組和104cfu組質(zhì)控樣品的儲藏穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表2。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，4 ℃保存的106cfu組樣品隨時間延長，穩(wěn)定性明顯下降，30 d時回收率只能達到51%，60 d的回收率只有15%。說明制備質(zhì)控樣品不適宜放置于4 ℃保存。放置于-20 ℃和-80 ℃保存的兩組樣品均保持了較好的穩(wěn)定性，說明低溫有助于保持菌體活性，這和微生物菌株定性保存是一樣的。長期的穩(wěn)定性考查，有待試驗進一步研究。

表2 不同溫度下儲存的定量質(zhì)控菌株的復(fù)蘇率

3.5質(zhì)控樣品的室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性檢測 本實驗中采用復(fù)現(xiàn)性臨界差值判斷，復(fù)現(xiàn)性臨界差值(CD)=0.38(R取0.45，r取0.25，n取13)。106cfu組13瓶樣品均一性檢測結(jié)果如表3顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為4.7×106cfu，那么控制范圍為1.9 ×106～1.1×107cfu(相當于本實驗的指定值為6.67，結(jié)果控制范圍為6.29～7.05)。本實驗13組數(shù)據(jù)均在上述范圍內(nèi)，質(zhì)控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。104cfu組13瓶樣品均一性檢測結(jié)果如表3顯示，樣品中金黃色葡萄球菌的平均量為5.6×104cfu，則控制范圍為1.3×105～2.3×104cfu(相當于本實驗的指定值為4.75，結(jié)果控制范圍為4.37～5.13)。本實驗所有數(shù)據(jù)均在上述范圍內(nèi)，質(zhì)控樣品中金黃色葡萄球菌的均一性可滿足定量需求。

表3 質(zhì)控樣品的室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性檢測結(jié)果

3.6質(zhì)控樣品的活力檢查 表4所列的8種樣品涵蓋了常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法處，均為微生物限度檢查常用方法。對三次試驗的回收率進行平均后，列于表4?？梢钥闯?，106cfu組與正常工作菌株的回收率沒有明顯區(qū)別，均符合《中國藥典》2015版要求。

表4 質(zhì)控樣品用于微生物限度計數(shù)方法學(xué)驗證試驗

4 討論

按照預(yù)先規(guī)定的條件，組織兩個或多個實驗室(工作人員)對相同或類似的物品進行測量或檢測，并對檢測結(jié)果進行評價，是有效的實驗室質(zhì)量控制手段，也是認可機構(gòu)確認實驗室檢測能力的技術(shù)手段[7]。通過參加比對實驗，有助于實驗室(實驗人員)了解自身的檢測水平，證明檢測能力，或者幫助其發(fā)現(xiàn)存在問題并采取有效措施進行糾正。近幾年，通過參加中國食品藥品檢定研究院、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院、英國政府化學(xué)家實驗室(LGC)和英國FEPAS檢測實驗室能力驗證等舉辦的多個能力驗證項目，實驗室檢測水平得到大幅提升。但是針對實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制，由于缺少微生物定量質(zhì)控菌株而較難進行。

4.1具有均勻性和穩(wěn)定性的定量質(zhì)控菌株是進行比對實驗的必要條件。本研究采用對數(shù)生長后期的金黃色葡萄球菌菌株，離心洗滌后獲得菌體，使用5%脫脂奶粉和5%海藻糖作為保護劑，制成106cfu含菌量、104cfu含菌量的凍存管。經(jīng)計數(shù)培養(yǎng)證明低溫保存的質(zhì)控樣品具有較好的均一性和穩(wěn)定性。

4.2在2014年舉辦的醫(yī)療器械檢測機構(gòu)能力驗證和比對實驗中，對于微生物計數(shù)項目的判定原則為：以測試結(jié)果的log為結(jié)果，指定值為3.83，各實驗室結(jié)果在“指定值±0.5log10”(即3.33～4.23)范圍為即為滿意。2013年LGC舉辦的李斯特菌數(shù)計數(shù)能力驗證項目中，根據(jù)公式Z=(x-X)/SDPA(x為參與者結(jié)果的log值，X為指定值，SDPA為0.35log10)，∣Z∣≤2為合格結(jié)果，那么實驗結(jié)果的控制范圍為“指定值±0.7 log 10”。在本實驗的均一性和室內(nèi)復(fù)現(xiàn)性檢測中，均采用復(fù)現(xiàn)性臨界差值進行判斷，分別取0.39和0.38，均小于上述控制標準，控制條件更為嚴格。均勻性試驗和室內(nèi)重復(fù)性檢測證明質(zhì)控樣品符合均一性要求，-20 ℃和-80 ℃保存具有較好穩(wěn)定性。

4.2質(zhì)控樣品的活力是限制其適用范圍的重要因素?！吨袊幍洹?015版非無菌產(chǎn)品的微生物限度檢查要求將供試液與工作菌株充分混合后，取樣進行培養(yǎng)計數(shù)。如果質(zhì)控樣品活力較差，與具有抑菌性的樣品混合后，生長就會被抑制，回收率降低。因此，本研究首次使用不同種類的樣品對106cfu組質(zhì)控樣品進行活力檢驗。分別考查了無明顯抑菌作用和具有不同抑菌效力共8種樣品的回收率試驗，發(fā)現(xiàn)質(zhì)控樣品組與正常工作菌株的回收率沒有明顯區(qū)別，均符合《中國藥典》2015版要求。這是關(guān)于適用于微生物限度檢查方法學(xué)適用性試驗的質(zhì)控樣品的首次報道。