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        復(fù)方丹參滴丸9種自制對(duì)照品純度定值研究

        2018-11-09 07:49:30羅學(xué)軍田介峰王瑞靜李瑞明宋兆輝
        天津藥學(xué) 2018年5期
        關(guān)鍵詞:酚酸內(nèi)標(biāo)純度

        羅學(xué)軍,田介峰,閻 紅,王瑞靜,李瑞明,宋兆輝,何 毅*

        (1.天士力控股集團(tuán)有限公司天士力研究院,天津 300410; 2.天士力醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司創(chuàng)新中藥關(guān)鍵技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300410)

        化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值國際上通常采用質(zhì)量守恒法,即分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的有關(guān)物質(zhì)、水分、殘留溶劑及無機(jī)雜質(zhì)的含量,其與主成分的含量之和應(yīng)為100%[1]。定量核磁共振(QNMR)技術(shù)作為一種日益成熟的儀器分析方法,具有傳統(tǒng)方法不可比擬的優(yōu)勢(shì),如無需待測(cè)物對(duì)照品、樣品預(yù)處理步驟簡單、測(cè)定快速準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、不破壞樣品,在藥品質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛[2-5]。復(fù)方丹參滴丸是全球首個(gè)由中國自主研發(fā)的產(chǎn)品完成美國FDA Ⅲ期臨床試驗(yàn),也是首個(gè)獲得美國FDA Ⅲ期臨床試驗(yàn)陽性結(jié)果的復(fù)方中藥[6],其質(zhì)控相關(guān)的對(duì)照品由企業(yè)自制獲得,自制對(duì)照品賦值的準(zhǔn)確性直接影響臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果,因此至關(guān)重要。本文通過上述2 種方法的定值比較研究,可以更好地保障企業(yè)自制對(duì)照品賦值的準(zhǔn)確性。

        1 儀器與試藥

        Agilent 1260高 效 液 相 色 譜 儀,美國Agilent;Advance DRX 500 Bruker型核磁共振儀,德國Bruker;METTLER XP205電子天平。丹參素鈉(批號(hào)20150323)、原兒茶醛(批號(hào)20150306)、丹酚酸A(批號(hào)20150329)、丹酚酸B(批號(hào)20150804)、丹酚酸T/U(批號(hào)20150330)、三七皂苷R1(批號(hào)20150421)、人參皂苷Rg1(批號(hào)20150415)、人參皂苷Re(批號(hào)20150428)和人參皂苷Rb1(批號(hào)20150415)對(duì)照品由天士力集團(tuán)研究院現(xiàn)代中藥開發(fā)中心自制;富馬酸對(duì)照品(批號(hào)20618)和馬來酸對(duì)照品(批號(hào)30318)采購自Dr. Ehrenstorfer GmbH;色譜純乙腈,Dikma;色譜純甲醇,Sigma;DMSO-d6,Merck;磷酸為分析純;水為自制超純水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1質(zhì)量守衡法計(jì)算相對(duì)純度

        2.1.1酚酸類對(duì)照品色譜純度檢測(cè)

        2.1.1.1液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:以0.02%磷酸水溶液為流動(dòng)相A,以乙腈-0.02%磷酸水溶液8∶2為流動(dòng)相B,進(jìn)行梯度洗脫;洗脫梯度:0~8 min,90%A→78%A,10%B→22%B;8~15 min,78%A→74%A,22%B→26%B;15~35 min,74%A→61%A,26%B→29%B;35~40 min,61%A→90%A, 39%B→10%B; 40~50 min, 90%A,10%B;流速: 1 ml/min;檢測(cè)波長:280 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量: 10 μl[7]。

        2.1.1.2檢測(cè) 取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B和丹酚酸T/U自制對(duì)照品,每份約5 mg,精密稱定,丹參素鈉和丹酚酸B用水,其余用甲醇分別溶解并制成每1 ml含0.2 mg 對(duì)照品的溶液,即得。在280 nm下檢測(cè),除主峰外,可見雜質(zhì)峰檢出,按峰面積歸一化法計(jì)算,結(jié)果見表1。

        2.1.2皂苷類對(duì)照品色譜純度檢測(cè)

        2.1.2.1液相色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:以水為流動(dòng)相A,以乙腈為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫;洗脫梯度:0~12 min,81%A,19%B;12~60 min, 81%A→64%A,19%B→36%B;60~61 min,64%A→81%A,36%B→19%B;61~70 min,81%A,19%B;流速:1 ml/min;檢測(cè)波長: 203 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量: 10 μl[8]。

        2.1.2.2檢測(cè) 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1對(duì)照品自制對(duì)照品,每份約4 mg,精密稱定,用甲醇分別溶解制成每 1 ml含0.4 mg 的溶液,即得。在203 nm下檢測(cè),除主峰外,可見雜質(zhì)峰檢出,按峰面積歸一化法計(jì)算,結(jié)果見表1。

        2.1.3水分 以上9種自制對(duì)照品按照USP37-NF29<921>Ⅰa所規(guī)定的Karl-Fischer 方法進(jìn)行水分測(cè)定,結(jié)果見表1。

        2.1.4殘留溶劑 按照USP37-NF32<467>所規(guī)定方法對(duì)各對(duì)照品進(jìn)行溶劑殘留分析,結(jié)果見表1。

        2.1.5灰分 按照USP37-NF29<281>所規(guī)定方測(cè)定各對(duì)照品中的灰分,結(jié)果見表1。

        2.1.6質(zhì)量守衡法計(jì)算結(jié)果 相對(duì)純度=色譜純度×(1-水分含量-殘留溶劑含量-灰分含量)×100%,計(jì)算各自制對(duì)照品相對(duì)純度,結(jié)果見表1。

        表1 9種自制對(duì)照品相對(duì)純度結(jié)果 %

        2.2核磁共振定量法計(jì)算絕對(duì)純度

        2.2.1供試品溶液的制備 分別取各對(duì)照品約15 mg及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(富馬酸、馬來酸)15 mg,精密稱定,一式2份,分別用0.7 ml DMSO-d6完全溶解,振蕩搖勻,即得。

        2.2.2核磁共振定量法測(cè)定結(jié)果 將供試品溶液約全部轉(zhuǎn)入5 mm核磁管中,測(cè)定。根據(jù)各對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)核磁共振譜圖,選擇定量峰進(jìn)行定量計(jì)算。絕對(duì)純度=(A樣/A內(nèi))×(n內(nèi)/n樣)×(W內(nèi)/W樣)×(M樣/M內(nèi))×內(nèi)標(biāo)物質(zhì)純度×100%。計(jì)算各對(duì)照品絕對(duì)純度,其中A樣為各對(duì)照品選定信號(hào)的積分面積,A內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)選定信號(hào)的積分面積,n樣為各對(duì)照品被積分信號(hào)包含的質(zhì)子數(shù),n內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)被積分信號(hào)包含的質(zhì)子數(shù),W樣為對(duì)照品稱樣量,W內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)稱樣量,M樣為各對(duì)照品相對(duì)分子質(zhì)量,M內(nèi)為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。結(jié)果以核磁共振定量法計(jì)算丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸T/U、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1絕對(duì)純度(n=2)依次為99.24%、100.48%、95.12%、95.22%、94.74%、99.11%、94.66%、98.22%和95.32%。

        3 討論

        3.1質(zhì)量守衡法涉及對(duì)照品色譜純度、水分、殘留溶劑和灰分等諸多測(cè)定環(huán)節(jié),核磁共振定量法測(cè)定絕對(duì)純度,不受水分、殘留溶劑和無機(jī)雜質(zhì)的影響,操作相對(duì)簡單。9種自制對(duì)照品丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸T/U、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1(相對(duì)純度-絕對(duì)純度)×100%分別為:-0.90%、-0.80%、-0.16%、-0.52%、-1.25%、-5.02%、2.42%、-3.76%和-0.54%。盡管2 種方法測(cè)定原理不同,但是除了三七皂苷R1和人參皂苷Re外其余測(cè)定結(jié)果基本一致,能夠更好地相互佐證9種自制對(duì)照品賦值的準(zhǔn)確性。

        3.2由于丹參素鈉中含有金屬元素Na,因此熾灼殘?jiān)鼨z查法無法準(zhǔn)確測(cè)定化合物中所含的不燃性無機(jī)物的含量,故其灰分測(cè)定結(jié)果僅供參考,沒有計(jì)入純度計(jì)算。

        3.3定量核磁技術(shù)尚未普及 ,且對(duì)于圖譜的處理及峰歸屬的判斷還不能完全實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化, 故 QNMR法暫時(shí)無法用于大批量樣品的分析。導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果偏差的因素包括溶劑的選擇——樣品易溶解、能去除活潑氫干擾、與定量峰不重疊;內(nèi)標(biāo)的品質(zhì)——含量準(zhǔn)確、溶解性好、與目標(biāo)物不重疊;定量峰的選擇——與內(nèi)標(biāo)物定量峰化學(xué)環(huán)境相近、不受旁邊峰的干擾[9]。

        3.4對(duì)照品定值準(zhǔn)確性是對(duì)照品的重要屬性,如何保證對(duì)照品量值準(zhǔn)確性是對(duì)照品研究的一項(xiàng)重要工作。天士力研究院在自制對(duì)照品研究中做了很多努力,也積累了很多經(jīng)驗(yàn)。本文在采用國際通用的質(zhì)量守衡法進(jìn)行賦值的同時(shí),進(jìn)一步采用核磁共振定量法加以佐證,更好地保障了對(duì)照品的賦值準(zhǔn)確性。但是作為一項(xiàng)極其嚴(yán)格的工作,不論是質(zhì)量守恒法還是核磁共振定量法,都需要對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行持續(xù)研究并進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證,才能更好地保障賦值結(jié)果的可靠性。

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