曾臻 譚強(qiáng)來 (通訊作者)

（廈門醫(yī)學(xué)院 福建 廈門 361023）

海洋共附生微生物的次級代謝產(chǎn)物常具有天然類藥性，是篩選新型藥物的寶庫[1]，是否具有抑菌活性是典型指標(biāo)之一[2]。韋榮編等人分離了東海海綿共附生微生物并篩選活性次級代謝產(chǎn)物[3]。林敏等人從海水、海泥樣中分離出29株具有抑菌活性的海洋細(xì)菌[4]。因此，本文擬通過傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)分離、純化海綿樣品中共附生微生物，并對拮抗金黃色葡萄球菌的活性菌株進(jìn)行篩選，為挖掘海洋微生物寶庫提供基本素材。

1.材料與方法

1.1 材料

海綿、金黃色葡萄球菌、E.coli DH5α由本實(shí)驗(yàn)室收集或保存，Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體購自大連寶生物，海水、LB培養(yǎng)基購自北京索萊寶，基因組DNA提取試劑盒購自北京天根。

1.2 海綿共附生微生物的分離和純化

海綿與無菌PBS混合勻漿，梯度稀釋后涂布海水培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)72h，觀察菌落生長狀態(tài)，挑取典型單菌落分離和純化。

1.3 拮抗篩查實(shí)驗(yàn)

以金黃色葡萄球菌為敏感指示菌用紙片法篩查。分離純化的菌株接種于海水培養(yǎng)基，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)72h，過濾得發(fā)酵液備用；金黃色葡萄球菌37℃、180r/min振蕩培養(yǎng)16h，按1%的量與溫?zé)酟B固體培養(yǎng)基混勻；凝固后貼入無菌紙片，加入發(fā)酵液；37℃培養(yǎng)16h，觀察抑菌效果。

1.4 16S rDNA菌株鑒定

挑選拮抗陽性菌株進(jìn)行16S rDNA鑒定。提取細(xì)菌基因組DNA，以27f和1492r通用引物PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測合格，TA克隆，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，挑選陽性克隆，上海生工測序。測序結(jié)果經(jīng)NCBI Blast同源性比對鑒定。

2.結(jié)果

2.1 菌株分離

經(jīng)海水培養(yǎng)基篩選，根據(jù)菌落的典型形態(tài)特征分類，共分離純化得到7株細(xì)菌。

2.2 拮抗篩查

經(jīng)紙片法篩查，其中編號為“2-10”的菌株對金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的拮抗作用（圖1）。

2.3 測序鑒定

16S rDNA測序，經(jīng)同源性比對，與登錄號“AB308441.1”匹配度為99%，經(jīng)鑒定為Bacillus pumilus（短小芽孢桿菌）。

圖1 紙片法篩查7株細(xì)菌對金黃色葡萄球菌的拮抗作用

3.討論

海洋共附生微生物由于協(xié)助宿主生長代謝或提供化學(xué)保護(hù)，常具有更豐富的代謝途徑，從而產(chǎn)生更多活性產(chǎn)物。尹慢慢等人分離出14株具有較高抑菌活性的發(fā)形霞水母共附生細(xì)菌[5]。作者前期也曾從噴喘苔海綿中篩選分離出25株共附生微生物[6]。與其他生物相比，海洋微生物種類多、生長周期短、菌種易選育，更具有潛在產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢。因此，本文從海綿共附生微生物中篩選并鑒定出一株強(qiáng)拮抗金黃色葡萄球菌的短小芽孢桿菌，具有較高的研究和應(yīng)用價(jià)值，為進(jìn)一步開發(fā)海洋微生物藥物奠定了基礎(chǔ)。