譚鴻霞 黃健云 吳曉枝

（中山市小欖人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 廣東 中山 528415）

尿本周蛋白是診斷和監(jiān)測(cè)多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的重要標(biāo)志物，同時(shí)也是多發(fā)性骨髓瘤引起腎功能損傷及療效預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)[1]。MM是常見的一種伴有繼發(fā)性腎臟病變的疾病，所致腎臟損害的發(fā)生率為60%～90%，其中50%的病例首發(fā)癥狀是蛋白尿或腎功不全來就診[2]。尿本周蛋白的檢測(cè)方法有熱沉淀法、免疫比濁法、免疫電泳法，但這些方法的影響因素較多，其特異性和敏感性不夠，檢出率低。瓊脂糖免疫固定電泳技術(shù)是一種利用蛋白電泳和抗原抗體相結(jié)合的一種特異性、敏感性及分辨率高的鑒別單克隆免疫球蛋白的方法，比骨髓細(xì)胞學(xué)檢出更早，有利于多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷[3]。瓊脂糖免疫固定電泳是一種分子篩分離技術(shù)，樣本濃度的高低對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有重要的影響。日常工作中常遇到尿蛋白偏高的樣本，這些標(biāo)本由于蛋白含量太高，各區(qū)帶堆積一起不能分區(qū)，且α區(qū)帶由于含量太高而易被洗脫，由此給結(jié)果的判讀帶來極大的困惑或漏診，給病人的診治有可能造成損害。廠家操作說明書上有提到如何濃縮樣本卻沒有提到對(duì)于這些高蛋白樣本該如何處理，才能做出準(zhǔn)確的結(jié)果的說明。很多MM患者早期是以頑固性腎病蛋白尿?yàn)槭装l(fā)癥狀就診的，尿蛋白偏高（尿常規(guī)蛋白≥3+或尿24小時(shí)蛋白定量≥2.0～4.0g/L）是常見癥狀之一。為此，我們研究了合理稀釋對(duì)高蛋白尿瓊脂糖免疫固定電泳結(jié)果準(zhǔn)確的重要性。本試驗(yàn)擬對(duì)20例尿本周蛋白偏高的樣本，分別對(duì)其進(jìn)行稀釋前與稀釋后的瓊脂糖免疫固定電泳結(jié)果比較，探討合理稀釋對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的重要性。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

20例高蛋白尿標(biāo)本均來自我院2017年3月—2017年12月的住院病人，其中男性14例，女性6例。尿蛋白定性檢測(cè)：患者空腹晨尿，利用全自動(dòng)尿干化學(xué)分析儀及配套試劑進(jìn)行尿蛋白的檢測(cè)。24小時(shí)尿蛋白者按相關(guān)要求留取24小時(shí)尿。

1.2 儀器與試劑

主要儀器與試劑（1）尿蛋白采用Iris IQ200全自動(dòng)尿液分析系統(tǒng)及其原裝配套試劑檢測(cè)（尿干化學(xué)批號(hào)7204190A）；（2）24小時(shí)尿蛋白采用羅氏Cobas8000全自動(dòng)生化分析儀及其原裝配套試劑檢測(cè)（TPUC尿液腦脊液總蛋白檢測(cè)試劑，批號(hào)33644801）；（3）瓊脂糖尿免疫固定電泳采用法國(guó)Se-bia公司生產(chǎn)的試劑盒HY-DRAGEL9BENCEJONES（批號(hào)04048/01），帶抗血清免疫球蛋白（批號(hào)07028/01系列）。采用EPSON PERFECTION V700 PHOTO掃描儀來完成全套工作步驟，以獲取分析所用的電泳圖譜膠片。

1.3 方法和步驟

尿蛋白定性≥3+或24小時(shí)蛋白定量2.0～4.0g/L判斷為高蛋白尿。選20份高蛋白尿標(biāo)本進(jìn)行瓊脂糖免疫固定電泳，步驟如下：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的預(yù)先設(shè)置，把同一高蛋白尿樣本進(jìn)行原倍和去離子水對(duì)倍稀釋后進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，其后步驟均依照操作說明進(jìn)行。

（1）選擇2/4BJ-UP電泳程序；（2）在ELP、GAM、κ、λ、κ-f、λ-f各齒梳孔上加10微升樣本；（3）用濾紙吸去堿性緩沖瓊脂糖膠片上多余的液體；（4）加200微升蒸餾水于框面下1/3處；（5）將點(diǎn)樣板分別放于3，9位置，按啟動(dòng)??；（6）經(jīng)過電泳后，依次加入ELP、GAM、κ、λ、κ-f、λ-f抗體；（7）將厚濾紙覆于凝膠上，吸去多余的抗血清；（8）烘干；（9）脫色－染色-顯色；（10）掃描電泳圖譜。

1.4 結(jié)果與判讀

ELP泳道相當(dāng)于血清蛋白電泳，在結(jié)果判斷中起對(duì)照作用，以對(duì)照標(biāo)本蛋白的電泳圖樣。其余5個(gè)泳道各自用相應(yīng)的抗血清GAM、κ、λ、κ-f、λ-f進(jìn)行免疫固定：GAM泳道加入抗IgG、IgA、IgM3種免疫球蛋白重鏈的混合抗血清，該泳道出現(xiàn)克隆帶即提示3種免疫球蛋白的其中1種呈克隆增生。κ和λ泳道加入抗結(jié)合型和游離型輕鏈的混合抗血清，標(biāo)本中只要有克隆性的輕鏈（與重鏈結(jié)合或游離于血中）存在，該泳道即出現(xiàn)克隆條帶。κ-f和λ-f泳道加入抗游離輕鏈抗血清，該泳道出現(xiàn)克隆條帶提示標(biāo)本中有單克隆游離輕鏈存在。

2.結(jié)果

對(duì)倍稀釋后均獲得較滿意的結(jié)果?，F(xiàn)將對(duì)比試驗(yàn)中的20例中的4例高蛋白尿瓊脂糖凝膠尿免疫固定電泳結(jié)果掃描圖譜報(bào)告如下。

圖1 原倍尿免疫固定電泳

圖2 對(duì)倍稀釋后免疫固定電泳

圖1標(biāo)本1～4號(hào)與圖2標(biāo)本1～4號(hào)在凝膠片上標(biāo)本與對(duì)應(yīng)位置均相同。

原倍尿免疫固定電泳與對(duì)倍稀釋后免疫固定電泳圖像掃描可見：

（1）1、3號(hào)標(biāo)本經(jīng)過稀釋后清晰可見，分別為λ型和K型，原倍標(biāo)本由于高濃度原因，堆集濃染現(xiàn)象較為嚴(yán)重，不利于結(jié)果判斷；（2）2、4號(hào)標(biāo)本經(jīng)過稀釋后，蛋白含量比例合適，電泳圖譜清晰，可報(bào)告為無反應(yīng)性；（3）經(jīng)過稀釋后，由于蛋白比例合適，原2，3號(hào)標(biāo)本高蛋白條帶上被洗脫而形成的蒼白區(qū)現(xiàn)象消失；（4）對(duì)倍稀釋后κ-f和λ-f游離輕鏈泳道各標(biāo)本均顏色較淺。

3.討論

瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法，瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過時(shí)會(huì)受到阻力，各種不同蛋白質(zhì)帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，在適合的濃度中，遷移的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開。瓊脂糖凝膠免疫固定電泳兼有“分子篩”、“電泳”“免疫分型”的三重作用。根據(jù)電泳的原理，濃度比例合適的樣本才利于其遷移分離，當(dāng)含量過高時(shí)各區(qū)帶不能分開，且α區(qū)帶由于含量太高而被洗脫。而合理稀釋后再電泳則各泳道的條帶清晰可見。從以上實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)κ-f、λ-f條帶由于含量不高，一般不用進(jìn)行稀釋，若全部不經(jīng)區(qū)別地稀釋會(huì)可能將其屏蔽而漏檢，κ-f、λ-f條帶是判斷MM的標(biāo)準(zhǔn)，所以κ-f、λ-f泳道的處理非常重要[4]。日常工作中常遇到本周蛋白偏高的樣本，各區(qū)帶不能分開，由此給結(jié)果的判讀帶來極大的困惑。廠家操作說明書上有提到如何濃縮樣本，卻沒有提到對(duì)于這些高蛋白樣本該如何處理才能做出準(zhǔn)確的結(jié)果的說明。目前，多發(fā)性骨髓瘤有上升趨勢(shì)，應(yīng)該把尿本周蛋白的瓊脂糖凝膠免疫固定電泳檢測(cè)列入臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目之中，同時(shí)要特別關(guān)注尿本周蛋白偏高且電泳結(jié)果染色堆集的樣本，要通過合理稀釋才能得出準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外還要加強(qiáng)多學(xué)科、多領(lǐng)域的合作研究，對(duì)快速準(zhǔn)確診斷、病情檢測(cè)、預(yù)后判斷多發(fā)性骨髓瘤等疾病有重要意義。