袁璞珺，張競超

近年來，隨著我國社會(huì)老齡化問題的日益嚴(yán)峻，冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟?，CHD）的發(fā)病率一直居高不下，大大增加我國的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前，臨床上主要采取經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）作為CHD的一線治療方案，但是易形成支架內(nèi)血栓，因此PCI術(shù)后輔以抗血小板藥物尤為重要[1]。氯吡格雷作為血小板表面二磷酸腺苷（ADP）受體拮抗劑，具有不可逆抑制血小板聚集的作用，廣泛用于CHD患者PCI術(shù)后抗血小板治療[2]。但是，有研究顯示，大約有4%～30%的患者對(duì)氯吡格雷缺乏反應(yīng)或反應(yīng)較低，稱為氯吡格雷抵抗[3]，及早診斷氯吡格雷抵抗對(duì)于選擇合理的抗血小板治療方案、預(yù)防微血栓形成具有十分重要的臨床價(jià)值。但是目前關(guān)于氯吡格雷抵抗的發(fā)生機(jī)制尚不明確，缺乏快速有效的特異性診斷手段，越來越多的研究證實(shí)，微小核糖核酸（miRNA）與血小板的活化密切相關(guān)[4]，但是關(guān)于miRNA與氯吡格雷抵抗發(fā)生的相關(guān)性研究尚少?；谇捌谘芯?，篩選血小板特異性高表達(dá)的miRNA作為候選標(biāo)志物，包括miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223，通過實(shí)驗(yàn)室方法檢測(cè)miRNA在PCI術(shù)后患者血小板中的表達(dá)情況，探討miRNA對(duì)氯吡格雷抵抗的潛在診斷價(jià)值?，F(xiàn)研究報(bào)告如下：

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象與分組連續(xù)入選2017年1月～2017年12月于河南省職工醫(yī)院心內(nèi)科行PCI術(shù)的CHD患者168例，其中男性95例，女性73例，年齡為46～79（61.43±7.26）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：所有患者經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確診為冠心??；首次服用氯吡格雷服；既往未接受過PCI術(shù)治療；由患者或家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)的患者；患者在治療前出現(xiàn)嚴(yán)重的意識(shí)障礙或心力衰竭者；合并嚴(yán)重的肝腎功能不全者；合并嚴(yán)重的血液系統(tǒng)疾病、急慢性感染或伴有嚴(yán)重出血傾向者；合并惡性腫瘤者；氯吡格雷或阿司匹林禁忌者；受試前服用低分子肝素、抗感染藥物、抗抑郁藥物、苯二氮卓類鎮(zhèn)靜催眠藥物者。根據(jù)檢測(cè)患者血小板聚集抑制率，分為氯吡格雷抵抗組（66例）和正常組（102例）。本項(xiàng)研究已獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 治療方法根據(jù)患者的病情，在住院期間采取病因治療、一般治療、藥物治療等。病因治療：治療基礎(chǔ)疾病和消除誘因。一般治療：休息和控制鈉鹽的攝入等。藥物治療：所有CHD患者進(jìn)行PCI術(shù)前給予300 mg負(fù)荷劑量的硫酸氫氯吡格雷片（商品名：波立維?，生產(chǎn)廠家：杭州賽諾菲制藥有限公司；生產(chǎn)批號(hào)：國藥準(zhǔn)字J20130083 ），術(shù)后繼續(xù)服用氯吡格雷片劑75 mg/d至少12個(gè)月。

1.2.2 氯吡格雷抵抗診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]采用光比濁法檢測(cè)以20 μmol/l二磷酸腺苷（ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集的通透度，血小板聚集活性（PAR）抑制率＜10%定義為氯吡格雷抵抗；否則為氯吡格雷反應(yīng)正常。血小板聚集抑制率=[（PAR處理前-PAR處理后）/PAR處理前]×100%。

1.2.3 血小板miRNA的檢測(cè)

1.2.3.1 純化血小板采集患者肘靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中；室溫下160 g離心6 min，取中層上清液，即為富血小板血漿；將富血小板血漿置于離心管中，室溫下300 g離心10 min，棄上清；加入3 ml Beads緩沖液重懸；加入40 ml人CD45磁珠beads試劑，室溫孵育45 min；采用磁性細(xì)胞分選系統(tǒng)收集血小板，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血小板純度。

1.2.3.2 提取總RNA收集血小板1×1010個(gè)，置于EP管中；加入1 ml預(yù)冷的Trizol，充分混合均勻，靜置5～10 min；加入200 μl氯仿，震蕩30 s，靜置5～10 min；12 000 rpm離心，取上清；加入500 μl異丙醇，震蕩30 s，靜置5～10 min；12 000 rpm離心，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，震蕩30 s，12 000 rpm離心，棄上清；將EP管倒置于濾紙上，將RNA充分干燥；加入20 μl DEPC水溶解沉淀，分裝，置于-80℃保存?zhèn)溆谩２捎媚z電泳檢測(cè)RNA分子量；采用分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度。

1.2.3.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄根據(jù)Taqman? MicroRNA reverse transcription kit和Taqman? MicroRNA assay kit試劑盒（日本Takara公司）說明書操作進(jìn)行。將cDNA保存至-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）將25 μl反應(yīng)體系（12.5 μl SYBR Premix Taq+2 μl引物+2 μl模板+8.5 μl雙蒸水）置于37℃恒溫水浴60 min，85℃ 5 s，加入去離子水至100 μl，各反應(yīng)孔取2 μl進(jìn)行PCR。冰浴中配制25 μl PCR反應(yīng)體系，95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s變性，60℃ 20 s退火，重復(fù)循環(huán)45次。引物序列如下： miR-26a（上游引物：5'-TGGCGATGGCAGTGTCTTAG-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'）；miR-26b（上游引物：5'-CAGCTTTGAGGTTCGTGTTTGT-3'；下游引物：5'- ATGCTCTTCTTTTTTGCGGAAA-3'）；miR-23a（上游引物：5'-CAGCTTTGAG GTTCGTGTTTGT-3'；下游引物：5'-ATGCTCT TCTTTTTTGCGGAAA-3'）；miR-223（上游引物：5'-GTGTGGAGCAACATCTGGCCTCTA-3'；下游引物：5'- TTGGTTCAGCCACTGCCGAT-3'）；β-actin（上游引物：5'-TGGCG A T G G C A G T G T C T T A G-3'；下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'）。

1.2.4 觀察指標(biāo)①血小板聚集情況：所有患者服用氯吡格雷之前采集靜脈血，以測(cè)定基礎(chǔ)水平血小板聚集情況，然后于治療結(jié)束后第2 d再次抽取靜脈血，再次測(cè)定血小板聚集情況。②血液生化指標(biāo)：采用Beckman coulter AU680全自動(dòng)血液生化分析儀（美國Beckman coulter）檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）、血紅蛋白（HGB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、血清肌酐（SCr）、尿酸（UA）、B型腦鈉肽（BNP）水平。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。使用多因素logistic回歸分析氯吡格雷抵抗發(fā)生的危險(xiǎn)因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較比較兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)（BMI）等基本資料，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05，表1）。

2.2 兩組患者血小板聚集反應(yīng)情況變化兩組患者治療后，氯吡格雷抵抗組患者經(jīng)10 μmol/L、20 μmol/L ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率分別為（11.81±2.54）%和（12.48±2.19）%，與治療前相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；但是高于氯吡格雷反應(yīng)正常組患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表1 患者的一般臨床資料分析

表2 兩組患者血小板聚集反應(yīng)情況（±s）

表2 兩組患者血小板聚集反應(yīng)情況（±s）

注：ADP：二磷酸腺苷；與本組治療前比較，aP＜0.05；與抵抗組治療后比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 抵抗組（n=66） 正常組（n=102）治療前 治療后 治療前 治療后ADP（10 μmol/L）12.25±1.43 11.81±2.54 11.69±2.77 4.65±1.08ab ADP（20 μmol/L）14.16±3.15 13.28±3.04 13.97±2.53 5.74±1.21ab

表3 兩組患者血液生化指標(biāo)比較

2.3 兩組患者血液生化指標(biāo)比較比較兩組患者的生化指標(biāo)，經(jīng)單因素分析結(jié)果顯示，兩組患者WBC、RBC、HGB值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＜0.05）。為排除基線資料可能對(duì)本項(xiàng)研究結(jié)果產(chǎn)生的影響，對(duì)上述存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的三項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行Logistc回歸分析，結(jié)果顯示，WBC、RBC、HGB不是發(fā)生氯吡格雷抵抗的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表3～4）。

表4 Logistic多因素回歸分析

表5 兩組患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表5 兩組患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

項(xiàng)目 抵抗組（n=66） 正常組（n=102） P值miR-26a 1.86±0.18 0.53±0.15 0.000 miR-26b 0.47±0.14 0.44±0.09 0.093 miR-23a 0.43±0.16 0.39±0.22 0.204 miR-223 1.17±0.29 0.34±0.07 0.000

2.4 兩組患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223相對(duì)表達(dá)水平的差異性基于前期生物信息學(xué)研究的基礎(chǔ)上，選取miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223作為候選基因，比較兩組患者血小板中候選基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，抵抗組患者血小板中miR-26a和miR-233表達(dá)水平明顯高于正常反應(yīng)組患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；其他兩種候選基因表達(dá)水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P均＞0.05）（表5）。

2.5 miR-26a和miR-233對(duì)于氯吡格雷抵抗的診斷價(jià)值經(jīng)ROC工作曲線分析miR-26a和miR-223對(duì)氯吡格雷抵抗的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-26a ROC曲線的AUC為0.715（95%CI：0.565～0.865），miR-223 ROC曲線的AUC為0.831（95%CI：0.718～0.945），而miR-26a和miR-223聯(lián)合ROC曲線AUC為0.922（95%CI：0.848～0.997）。當(dāng)miR-26a相對(duì)表達(dá)量為1.24時(shí)，Youden指數(shù)最大，因此miR-26a的診斷閾值為1.24，此時(shí)miR-26a診斷氯吡格雷抵抗的敏感性為78.4%，特異性為60.5%；當(dāng)miR-223相對(duì)表達(dá)量為0.86時(shí)，Youden指數(shù)最大，因此miR-223的診斷閾值為0.86，此時(shí)miR-223診斷氯吡格雷抵抗的敏感性為82.3%，特異性為57.2%；另外，miR-26a和miR-223聯(lián)合診斷的敏感性和特異性分別為92.7%，87.6%。結(jié)果提示，miR-26a和miR-223聯(lián)合診斷價(jià)值高于單獨(dú)診斷價(jià)值（圖1）。

3 討論

冠心病作為一種嚴(yán)重危害人類健康的心腦血管疾病之一，死亡率和致殘率較高，病因復(fù)雜，給患者家庭增加極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。而急性心肌梗死是導(dǎo)致冠心病患者死亡的重要原因之一，與冠狀動(dòng)脈不穩(wěn)定斑塊破裂迅速形成血栓密切相關(guān)[6]。斑塊一旦破裂，血小板迅速聚集形成白色血栓，通常表現(xiàn)為非ST段持續(xù)抬高心肌梗死；若斑塊破裂嚴(yán)重，則會(huì)大量黏附纖維蛋白形成紅色血栓，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈完全閉塞，形成ST段持續(xù)抬高心肌梗死[7]。目前對(duì)于心肌梗死的治療目的，首先需盡快恢復(fù)冠狀動(dòng)脈的血流灌注，但是抗血栓治療也是治療的重要環(huán)節(jié)之一[8]。而氯吡格雷是預(yù)防冠心病患者臨床主要不良心血管事件發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。

圖1 miR-26a、miR-223在氯吡格雷抵抗和正常反應(yīng)之間的ROC曲線

在本項(xiàng)研究中，采用臨床上最常使用的比濁度法用于檢測(cè)PCI術(shù)患者服用氯吡格雷前后的血小板活性，并根據(jù)血小板聚集抑制率分為抵抗組和正常反應(yīng)組，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另有研究顯示，氯吡格雷抵抗可能與遺傳因素、吸煙史、糖尿病史等有關(guān)。在本項(xiàng)研究中，氯吡格雷抵抗組患者和正常反應(yīng)組患者一般臨床特征未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而避免對(duì)研究目的的影響。氯吡格雷屬于新型抑制血小板聚集的噻吩砒啶類衍生物，主要通過不可逆地阻斷二磷酸肌酐受體，從而抑制纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，從而抑制血小板聚集[10]。理論上，氯吡格雷具有很強(qiáng)的抗血小板活性作用，但是在實(shí)際臨床應(yīng)用中，很多患者服用氯吡格雷血小板后無反應(yīng)或低反應(yīng)。目前關(guān)于氯吡格雷抵抗的發(fā)生機(jī)制尚不明確，但普遍認(rèn)為血小板活化因子在氯吡格雷抵抗發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[11]。經(jīng)血小板活化因子的誘導(dǎo)，ADP參與血小板聚集信號(hào)的放大過程[12]，血管受損后，血小板在膠原蛋白、血友病因子等影響下聚集到受損血管壁上，經(jīng)腎上腺素、降鈣素原等因子活化后，釋放ADP，激活血小板表面的糖蛋白受體，與纖維蛋白原結(jié)合，導(dǎo)致血小板聚集[13]。2003年，Muller等[14]學(xué)者首先提出氯吡格雷抵抗事件，并認(rèn)為ADP誘導(dǎo)的血小板聚集抑制率＜10%即定義為氯吡格雷抵抗。

miRNA是真核生物基因中一類非編碼的負(fù)性調(diào)控RNA，可以通過與靶基因3’-非編碼區(qū)結(jié)合抑制RNA轉(zhuǎn)錄[15]。目前，關(guān)于miRNA與腫瘤和心腦血管疾病之間的關(guān)系研究已經(jīng)成為全球醫(yī)學(xué)界的熱點(diǎn)，但是國內(nèi)外在關(guān)于miRNA是否也參與氯吡格雷抵抗的發(fā)生以及哪些靶基因可能作為氯吡格雷抵抗診斷的候選標(biāo)志物方面研究尚少。筆者通過前期生物信息學(xué)和基因芯片技術(shù)，初選氯吡格雷抵抗患者與正常反應(yīng)患者具有表達(dá)差異性的miRNA譜，結(jié)果顯示，氯吡格雷抵抗的患者血小板中miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223、miR-191、miR-484等多種基因呈高表達(dá)，選擇前四種基因作為本項(xiàng)研究的候選基因。另外，由于基因芯片技術(shù)雖然簡單易行，篩選信息量大，但是敏感度較低，而且成本昂貴，RT-qPCR是目前實(shí)驗(yàn)室和臨床檢驗(yàn)科最常使用的可靠的檢測(cè)方式，本項(xiàng)研究通過RT-qPCR檢測(cè)兩組患者血小板中miRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，在miR-26a、miR-26b、miR-23a、miR-223四種候選基因中，氯吡格雷抵抗組患者血小板中miR-26a和miR-233表達(dá)水平明顯高于正常反應(yīng)組患者，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），其他兩種候選基因表達(dá)水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。進(jìn)一步分析miR-26a、miR-223對(duì)氯吡格雷抵抗的臨床診斷價(jià)值，結(jié)果顯示，miR-26a和miR-223單獨(dú)和聯(lián)合診斷ROC工作曲線下面積分別為0.715，0.831，0.922，特異性和敏感性分別為78.4%和60.5%，82.3%和57.2%，92.7%和87.6%，聯(lián)合診斷的臨床價(jià)值、敏感性和特異性明顯提高。

綜上所述，氯吡格雷抵抗患者血小板中miR-26a和miR-223表達(dá)較正常反應(yīng)者明顯上調(diào)，聯(lián)合檢測(cè)血小板中miR-26a和miR-223的表達(dá)水平可作為氯吡格雷抵抗的診斷方法，具有良好的臨床推廣價(jià)值。