何呂富，雷 巧，梅洪建

(九○三醫(yī)院：1.消化科；2.檢驗科，四川江油 621700)

核苷(酸)類似物(NAs)因服藥方便，抗乙型肝炎病毒(HBV)作用強，不良反應少等優(yōu)勢，在臨床上被廣泛用于治療慢性乙型肝炎(CHB)[1]。由于NAs主要抑制HBV復制的反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)，對共價閉合環(huán)狀脫氧核糖核酸無直接抑制或清除作用，很難徹底清除HBV，需要長期進行抗HBV治療[2]。隨著用藥時間的延長，患者可能對NAs產(chǎn)生耐藥，耐藥不僅可導致疾病進一步進展，并可增加發(fā)生肝功能失代償和肝癌的風險，還會增加后續(xù)治療的難度和成本[3]。如何能減少NAs治療的耐藥和正確處理耐藥是一個急需解決的問題。本研究采用回顧性研究方法，對長期使用NAs治療的耐藥位點陽性CHB患者進行分析，為臨床合理用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 2006年5月至2017年5月本院長期使用NAs治療，出現(xiàn)病毒學突破或反彈，并且檢測耐藥位點陽性的CHB患者67例，其中男56例，女11例；年齡18～78歲，平均(44.85±15.76)歲；CHB患者35例，CHB肝硬化患者32例。單用拉米夫定(LAM)組15例，口服LAM，每次100 mg，每天1次，療程2～7年。單用阿德福韋酯(ADV)組25例，口服ADV，每次10 mg，每天1次，療程2～8年。序貫治療組27例，序貫治療即LAM治療出現(xiàn)病毒學突破序貫ADV，或ADV治療出現(xiàn)病毒學突破序貫LAM，治療再出現(xiàn)病毒學突破序貫恩替卡韋(ETV)，ADV(口服,每次10 mg，每天1次)、LAM(口服，每次100 mg，每天1次)、ETV(口服，每次0.5 mg，每天1次)療程2～10年。所有患者診斷均符合中華醫(yī)學會肝病學分會、中華醫(yī)學會感染病學分會2015年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》標準[1]。

1.2方法 (1)用全自動生化分析儀檢查血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)；(2)用化學發(fā)光法檢測HBV標志物；(3)用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)檢測HBV DNA定量(HBV DNA>1×103copy/mL為陽性)。(4)HBV基因分型和耐藥位點檢測嚴格按上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司HBV基因分型和耐藥位點檢測試劑盒的要求操作，統(tǒng)一由四川金域醫(yī)學檢驗中心檢測。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1耐藥位點檢測 單用ADV組主要耐藥位點N236T 13例,A181V 14例,A181T 7例，A181S 1例，見表1。

單用LAM組主要耐藥位點M204V/I 11例，其中M204V+L180M 7例、M204I 4例，次要位點L180M 7例、A181T 1例、L229M/V 3例、Q215H 1例、V173L 1例、L80I 2例、S213T 2例、V207M 2例，見表2。

序貫治療組中耐藥位點有LAM耐藥特征的20例，主要耐藥位點為M204V+L180M 14例，M204V/I+L180M 1例，M204I 5例；有ADV耐藥特征的15例，主要耐藥位點為A181T/V 9例，N236T 6例；有ETV耐藥特征的10例，主要耐藥位點為S202G 7例，T184A/I 3例。次要耐藥位點包括ADV次要耐藥位點V214A 1例，S85A 1例；LAM次要耐藥位點L80V/I 2例，A213T 3例，L229F/M/W 3例，見表3。

表1 單用ADV組耐藥變異檢出情況

注：R表示耐藥；I表示敏感性降低；TDF為替諾福韋酯

表2 單用LAM治療組耐藥變異檢出情況

注：U代表敏感性可能降低；LDT為替比夫定

表3 序貫治療組耐藥變異檢出情況

續(xù)表3 序貫治療組耐藥變異檢出情況

2.2基因型與主要耐藥位點分布 該組患者檢測出基因型B 37例，基因型C 30例，對兩基因型主要耐藥位點分布進行比較，兩基因型主要耐藥位點分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 基因型與主要耐藥位點分布

3 討 論

LAM、ADV、ETV是我國目前治療CHB的主要NAs藥物[1]。NAs主要通過抑制HBV聚合酶的RT區(qū)活性，阻止HBV復制過程中以HBV的前基因組RNA為模板反轉(zhuǎn)錄生成新的病毒RNA，從而發(fā)揮抑制病毒復制的作用[4]。病毒為了生存，在復制中將HBV聚合酶區(qū)某些特定部位的氨基酸進行置換，置換后藥物對病毒的結合力及敏感性下降[5]，由于CHB需要進行長期抗病毒治療，隨著治療時間的延長，不但耐藥發(fā)生率不斷升高，而且耐藥性也越來越復雜，正在從單藥耐藥向多藥耐藥轉(zhuǎn)化。本研究對病毒學突破或反彈并且耐藥位點檢測陽性的67例CHB患者進行分析，單用ADV組檢出耐藥位點有N236T 13例(52%),A181V 14例(56%),A181T 7例(28%)，A181S 1例(4%)，主要耐藥位點與既往研究一致[6-7]，N236T和A181T/V/S均可導致HBV對ADV耐藥[8-9]。單用LAM組主要耐藥位點M204V/I 11例(73.33%)，該變異位點可導致HBV對LAM耐藥，體外試驗顯示該變異株對LAM敏感性下降1 000倍以上。次要位點L180M、Q215H、V173L、L80I、V207M均為LAM的代償性突變，可增強病毒復制能力，M204I常單獨出現(xiàn)，M204V常與L180M聯(lián)合出現(xiàn)[10]，A181T位點突變在LAM治療患者中占2%，可在沒有M204V/I的情況下發(fā)生，同時導致HBV對ADV和LAM敏感性下降[11]，屬原發(fā)耐藥位點。該組還查出L229M/V 3例，2例與M204V聯(lián)合出現(xiàn)，1例單獨出現(xiàn)。紀冬等[12]認為L229位點突變也是LAM的代償性突變，可以增強病毒的耐藥性和復制能力。該組還查出S213T 2例，1例與M204I聯(lián)合出現(xiàn)，1例單獨出現(xiàn)，2例均出現(xiàn)病毒學反彈和ALT升高，與孟玉麗等[13]報道一致，提示S213T可能也是LAM的代償性耐藥位點，并且可增強病毒耐藥性和復制能力。

序貫治療組存在多藥耐藥特征，其中有LAM耐藥特征的耐藥位點為M204V+L180M 14例，M204V/I+L180M 1例，M204I 5例；有ADV耐藥特征的耐藥位點為A181T/V 9例，N236T 6例；有ETV耐藥特征的耐藥位點為S202G 7例，T184A/I 3例；L80V/I 2例、A213T 3例、L229F/M/W 3例是LAM次要耐藥位點；V214A 1例和S85A 1例被認為是ADV的次級突變位點[10]，與ADV耐藥有關，多藥耐藥15例(55.56%)，長期NAs單藥序貫治療容易出現(xiàn)針對多種NAs的耐藥位點，發(fā)生多藥耐藥。ETV耐藥是在LAM耐藥(M204V/I+L180M)基礎上，加上三個位點之一(S202、T184、M250)的聯(lián)合突變才能產(chǎn)生耐藥[5]，該組病例發(fā)生ETV耐藥10例，均是在LAM耐藥基礎上再序貫ETV所致。因此，LAM耐藥患者用ETV再治療容易發(fā)生ETV耐藥，ETV初治患者5年耐藥率為1.2%，LAM耐藥后改用ETV，ETV 5年耐藥率可達到51.0%[4]。研究還發(fā)現(xiàn)，基因型B和基因型C主要耐藥位點分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)[14]。

綜上所述，NAs長期治療CHB必然出現(xiàn)耐藥[3]，及時進行耐藥基因檢測對耐藥患者再治療很重要。高耐藥、低基因屏障藥物序貫治療容易導致多藥耐藥。LAM耐藥患者再序貫ETV治療容易導致ETV耐藥。初始治療時盡量選用強效、高耐藥基因屏障藥物，避免高耐藥、低基因屏障藥物序貫治療才能減少耐藥，特別是多藥耐藥的發(fā)生。