陳永亮， 高 尚， 王彥紅

(1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇徐州 221006； 2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

由于耐藥菌的持續(xù)出現(xiàn)與存在，研究者希望能獲得生物的抑菌方法，近年來(lái)芽孢桿菌發(fā)展為益生菌，被廣泛應(yīng)用于豬飼養(yǎng)、禽業(yè)及水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)[1]。候選益生菌菌株主要有蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)等[2-3]。2017年6月從江蘇省揚(yáng)州市高郵市某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的散養(yǎng)草雞中分離出2株芽孢桿菌，經(jīng)鑒定1株為短小芽孢桿菌(B.pumilus)，另1株為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，對(duì)2株細(xì)菌的生化特點(diǎn)、耐藥性及其對(duì)其他細(xì)菌的抑制作用等生物學(xué)特性作初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

將牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基溶化，待涼至50 ℃左右時(shí)按5%的比例加入無(wú)菌綿羊血配成血瓊脂培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中，4 ℃保存?zhèn)溆?。牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基購(gòu)自上海中科昆蟲(chóng)生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管和藥敏試紙購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

2017年6月從江蘇省揚(yáng)州市高郵市某養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)的600只110日齡散養(yǎng)草雞中取2只消瘦的病雞剖殺，主要病變?yōu)楦文[大且有白色斑點(diǎn)，脾腫大，腺胃腫大。取肝、脾、肺等組織器官，按常規(guī)無(wú)菌操作接種于血瓊脂平板上，并于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落分別在麥康凱培養(yǎng)基與血瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察分離菌的生長(zhǎng)狀況和菌落形態(tài)特征。再挑選單個(gè)菌落用革蘭氏染色，并于顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3 MALDI biotyper分析

參照MALDI biotyper分析儀的操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行單個(gè)菌落點(diǎn)樣、晾干，然后加1 μL甲酸混勻、再晾干后進(jìn)機(jī)器MBT(購(gòu)自德國(guó)Bruker公司，型號(hào)microflex)檢測(cè)，采用flex control程序進(jìn)行檢測(cè)[4]。

1.4 16S rRNA基因測(cè)序

挑取單個(gè)菌落加入20 μL的16S-free H2O水中，煮沸，裂解，制備其DNA模板，按照寶生物工程(大連)有限公司的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)大小為 500 bp 的目的片段，然后將剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生化試驗(yàn)

用接種針挑取純化后細(xì)菌的單個(gè)菌落，按常規(guī)方法分別進(jìn)行葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖、木糖、棉子糖、甘露醇、鼠李糖、果糖、衛(wèi)茅醇、阿拉伯糖等糖或醇類(lèi)生化發(fā)酵試驗(yàn)，以及甲基紅(MR)、二乙酰(VP)、硫化氫、淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、蛋白胨水(吲哚)等試驗(yàn)。另外進(jìn)行耐鹽(7% NaCl)試驗(yàn)檢測(cè)，置37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer藥敏紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，所用藥敏紙片包括頭孢三嗪(菌必治)、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左旋氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素等15種，具體操作步驟為在無(wú)菌條件下，挑取純化后的單個(gè)菌落均勻涂布于血瓊脂平板上，取6 mm藥敏紙片貼于平板瓊脂面上，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果，測(cè)量各抗生素紙片的抑菌圈直徑。

1.7 分離菌對(duì)其他細(xì)菌的抑菌性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5-6]采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)，把臨床分離的雞源大腸桿菌、雞源金黃色葡萄球菌和雞白痢沙門(mén)菌分別接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、150 r/min 條件下培養(yǎng)72 h，取100 mL菌液以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，將下部沉淀用生理鹽水稀釋成1×108CFU/mL的菌懸液，其中雞源大腸桿菌和雞源金黃色葡萄球菌懸液均勻涂布在厚度約為4 mm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，雞白痢沙門(mén)菌懸液均勻涂布在厚度約為4 mm的血平板上，然后在平板上打直徑約為4 mm的孔，封底。用相同方法制備的芽孢桿菌菌懸液加滿孔，每個(gè)菌株加樣3個(gè)孔，置于適宜溫度下培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑(φ)，取平均值。判斷標(biāo)準(zhǔn)[6]：φ≤5 mm，不敏感；5 mm<φ≤10 mm，低度敏感；10 mm<φ<15 mm，中度敏感；φ≥15 mm，高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

將病原菌材料接種于血瓊脂平板上，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀察發(fā)現(xiàn)，在接種脾臟組織的血瓊脂平板上出現(xiàn)完全溶血的菌落，命名為201706JS，血瓊脂平板鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖1；在接種肝臟組織的血瓊脂平板上出現(xiàn)不溶血的較大不光滑菌落，命名為201706JL，血瓊脂平板鏡檢結(jié)果見(jiàn)圖2，2株分離菌在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均不生長(zhǎng)。其他組織接種后放置48 h仍無(wú)可疑菌落出現(xiàn)。

2.2 MALDI biotyper分析結(jié)果

MALDI biotyper分析發(fā)現(xiàn)，2株分離菌中的201706JS為短小芽孢桿菌(B.pumilus)，201706JL為巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。

2.3 16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及序列分析

2株分離菌的16S rRNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后[7]，出現(xiàn)大小為500 bp左右的目的條帶，將所測(cè)得的序列結(jié)果(圖3、圖4)在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，結(jié)果表明，所獲得的序列201706JS與短小芽孢桿菌(B.pumilus)(序列號(hào)：KU928365.1)的同源性為100%，201706JL與巨大芽孢桿菌(B.megaterium)(序列號(hào)：KY417160.1)的同源性為100%。

2.4 生化特性

由表1可知，2株分離菌均能發(fā)酵葡萄糖、果糖，并能夠水解淀粉，但不能水解乳糖、蔗糖等糖類(lèi)，耐鹽試驗(yàn)呈陽(yáng)性，MR、VP試驗(yàn)為陰性。

表1 2株分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

注：“-”表示陰性；“+”表示陽(yáng)性。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果(表2)顯示，2株分離菌對(duì)常用抗生素強(qiáng)力霉素、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、卡那霉素、 丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、鏈霉素、左旋氧氟沙星等均敏感。

表2 2株分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.6 分離菌對(duì)其他細(xì)菌的抑菌性試驗(yàn)

由表3可知，雞源大腸桿菌對(duì)分離的短小芽孢桿菌(201706JS)和巨大芽孢桿菌(201706JL)都低度敏感，雞源金黃色葡萄球菌對(duì)短小芽孢桿菌(201706JS)低度敏感，但是雞白痢沙門(mén)菌對(duì)2株細(xì)菌均不敏感。

表3 2株分離菌對(duì)其他細(xì)菌的抑菌結(jié)果

3 討論

本研究從散養(yǎng)草雞的脾和肝中分別分離出短小芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌各1株，通過(guò)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，分別為短小芽孢桿菌(B.pumilus)和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)。這2株芽孢桿菌對(duì)強(qiáng)力霉素、諾氧沙星、氟苯尼考、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、鏈霉素、左旋氧氟沙星常用抗生素均敏感，由此可知，在臨床上使用抗生素不僅容易造成致病菌的耐藥性，更會(huì)殺滅益生菌，引起家禽體內(nèi)菌群失調(diào)，因此在家禽生產(chǎn)中不能一味使用抗生素，須全面考慮用藥的正面和負(fù)面影響。2株芽孢桿菌對(duì)常見(jiàn)病原菌尤其是對(duì)雞源大腸桿菌均有一定抑制性，初步具備了優(yōu)良的益生菌株條件，加上芽孢桿菌自有的較強(qiáng)可逆性和益生性，適合用作生產(chǎn)家禽微生態(tài)制劑[8-9]。但從已知的文獻(xiàn)可以看出，益生菌在體外試驗(yàn)中由于受各種因素以及細(xì)菌本身特性的影響，對(duì)致病菌的抑制性差異比較大，張紅英等在抑菌試驗(yàn)中將芽孢桿菌菌液濃縮10倍，獲得了較好的抑菌效果[10]，因此運(yùn)用此類(lèi)芽孢桿菌生產(chǎn)微生態(tài)制劑用于抗菌抑菌時(shí)應(yīng)該注意加工和使用方法，這也是筆者所承擔(dān)2個(gè)基金項(xiàng)目研究中草藥配伍芽孢桿菌來(lái)替代抗生素的一個(gè)初衷。