陳 琳， 管遠(yuǎn)紅， 黃東璋， 齊富剛， 魏冬霞， 陳瀛川， 張 歡， 王亞南， 蘇哲君，張洪濤， 區(qū)卓麟， 陳冬冬， 吳懷秀， 于淼淼， 楊雨秋

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 22530)

抗耐藥菌感染已成為世界性難題，研究細(xì)菌耐藥機(jī)制，針對(duì)耐藥機(jī)制尋求新的抗感染藥物，尋找一些增強(qiáng)或保護(hù)現(xiàn)有抗菌藥物抗菌活性的物質(zhì)，已成為抗感染治療尤其是抗耐藥菌感染治療的一個(gè)重要研究方向。

16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶是近年來出現(xiàn)的一種介導(dǎo)臨床菌對(duì)氨基糖苷類抗生素尤其是對(duì)4，5-及4，6-二脫氧鏈霉胺類氨基糖苷抗生素高度耐藥的核糖體RNA甲基轉(zhuǎn)移酶[1]。編碼16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的基因大多位于質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子、插入序列共同區(qū)等可動(dòng)遺傳因子上，具有易于傳播和擴(kuò)散的特點(diǎn)[2-5]。目前，幾乎世界各地均有16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶耐藥臨床菌出現(xiàn)的報(bào)道，且有不斷增多的趨勢(shì)[6-8]，這給臨床抗革蘭氏陰性菌感染治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。因此，通過系統(tǒng)研究16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶耐藥機(jī)制，建立有效的藥物篩選模型，尋找有效的藥物來抑制16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性或進(jìn)一步恢復(fù)耐藥菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物的敏感性或降低細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類的耐藥性具有重要的理論及臨床意義。基于此，本研究進(jìn)行了16S rRNA甲基化酶RmtB耐藥重組菌的構(gòu)建及其穩(wěn)定性研究，以期為抗耐藥菌藥物篩選奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

16S rRNA甲基化酶陽性菌Escherichiacoli(編號(hào)P-25)，自臨床腹瀉豬分離，經(jīng)PCR檢測(cè)鑒定攜帶16S rRNA甲基化酶RmtB。工程菌E.coliJM109，購(gòu)自TaKaRa生物試劑公司。質(zhì)控菌E.coliATCC 25922，購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

水解酪蛋白肉湯(MH Broth)、LB肉湯及LB瓊脂等，均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要試劑

EmeraldAmp Max PCR Master Mix、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ(8～20 U/μL)及SalⅠ(8～20 U/μL)，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 (50 ng/μL)、250 bp DNA ladder、克隆載體pMD18-T Vector、TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0，TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 供試藥物

共10種藥物，阿米卡星(效價(jià)630 μg/mg)、硫酸慶大霉素(效價(jià)592 μg/mg)、新霉素(效價(jià)652 U/mg)、大觀霉素(效價(jià)650 U/mg)，均購(gòu)自某質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。氯霉素(99.3%)、氨芐西林(95%)、頭孢唑林(99.3%)，均購(gòu)自杭州某微生物試劑有限公司。氟苯尼考(98.63%)，購(gòu)自浙江某藥業(yè)有限公司。恩諾沙星(98.7%)，購(gòu)自上虞某藥業(yè)有限公司。多西環(huán)素(84.56%)，購(gòu)自河北某制藥有限公司。

1.5 方法

1.5.1 16S rRNA甲基化酶RmtB全基因的PCR擴(kuò)增 應(yīng)用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0提取DNA。設(shè)計(jì)RmtB全序列引物RmtB-F：5′-CTGT-CAGACCAAGTTTACTC-3′；RmtB-R：5′-GGCGCTGT-AAGTATAATGGC-3′，均由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。確定PCR反應(yīng)體系[9]，利用梯度PCR確定最佳循環(huán)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。取適量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以DL 2 000的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)做參考，以6 V/cm的電壓，用1.5%～2.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)束后拍照分析電泳結(jié)果。

1.5.2 RmtB的克隆、轉(zhuǎn)化及鑒定 按照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 DNA片段純化回收試劑盒使用說明操作，回收帶全長(zhǎng)基因的PCR產(chǎn)物。將回收的目的DNA片斷與pMD18-T載體連接，在16 ℃條件下反應(yīng)1 h，同時(shí)按分子克隆試驗(yàn)指南操作[10]制備感受態(tài)細(xì)胞并確定RmtB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化體系，然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，挑取白色菌落，使用菌落或菌液PCR法確認(rèn)載體中插入片段的長(zhǎng)度大小。用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行電泳和含量測(cè)定。依照RmtB重組質(zhì)粒雙酶切鑒定體系(表1)，用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒DNA，37 ℃恒溫水浴4 h后，取5～10 μL酶切產(chǎn)物，1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察重組菌提取結(jié)果。同時(shí)將菌落PCR及雙酶切鑒定陽性菌落送至華大基因進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果采用DNA Star 6.0與GenBank上下載的序列進(jìn)行MegAlign。

1.5.3 RmtB重組菌的藥物敏感性檢測(cè) 選取受試藥物，按照CLSI的指導(dǎo)原則選取溶劑進(jìn)行配制和稀釋，在MH瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種于2 mL Muller-Hinton(MH)肉湯管中，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～8 h，用調(diào)節(jié)過Ca、Mg離子的MH肉湯稀釋菌液，使稀釋菌液達(dá)到0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫?，再?1 ∶100 稀釋菌液至含菌量約為1×106CFU/mL。然后進(jìn)行MICs測(cè)定，記錄藥敏試驗(yàn)結(jié)果，以MIC值位于美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(the Clinical and Laboratory Standards Institute，簡(jiǎn)稱CLSI)規(guī)定的敏感(susceptible，S)、中介(intermediate，I)、耐藥(resistance，R)折點(diǎn)值范圍判斷藥敏試驗(yàn)結(jié)果。CLSI規(guī)定的10種藥物敏感、中介、耐藥折點(diǎn)值判斷標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表1 RmtB重組質(zhì)粒雙酶切鑒定體系

表2 藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.5.4 RmtB重組菌的穩(wěn)定性研究 取RmtB重組大腸桿菌接種于不含阿米卡星、慶大霉素及氨芐西林的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。2 d再挑取平板上的菌落接種于LB固體培養(yǎng)基，重復(fù)以上操作，連續(xù)傳3代。將上述連續(xù)傳了3代的重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液D600 nm值約為0.6。再按照1 ∶100比例接種于LB肉湯的試管中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、26、28、30、32 h后測(cè)定菌液的D600 nm。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液D600 nm值為縱坐標(biāo)，繪出重組菌的生長(zhǎng)曲線，測(cè)定重組質(zhì)粒傳代以后的最低抑菌濃度(MICs)。

2 結(jié)果

2.1 16S rRNA甲基化酶RmtB編碼基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

以16S rRNA甲基化酶陽性菌E.coli(編號(hào)P-25)提取的DNA為模板，用含RmtB全基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到目的片段RmtBP-25(圖1)。

2.2 16S rRNA甲基化酶RmtB編碼基因的克隆轉(zhuǎn)化及結(jié)果

回收16S rRNA甲基化酶RmtB全基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將回收片段與pMD18-T載體連接，并按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，挑取4個(gè)白色菌落，分別命名為pRmtB1、pRmtB2、pRmtB3、pRmtB4。提取4個(gè)重組質(zhì)粒DNA進(jìn)行電泳，結(jié)果見圖2。

2.3 RmtB重組菌的菌落PCR鑒定結(jié)果

由圖3可知，4個(gè)重組質(zhì)粒中，只有3個(gè)pRmtB1、pRmtB2及pRmtB4中含有rmtB全基因。

2.4 RmtB重組菌的雙酶切鑒定結(jié)果

經(jīng)菌落PCT鑒定陽性的重組質(zhì)粒雙酶切鑒定及結(jié)果見圖4。

2.5 RmtB重組菌的序列分析鑒定結(jié)果

上述3個(gè)經(jīng)菌落PCR及雙酶切鑒定呈陽性的重組菌，送上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果用DNAStar 6.0與GenBank上下載的序列進(jìn)行MegAlign。結(jié)果證實(shí)，16S rRNA甲基化酶RmtB成功轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109中。

2.6 RmtB重組菌的藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果

RmtB重組菌對(duì)10種藥物的MICs，由表2可知，3株重組菌均對(duì)阿米卡星、慶大霉素及氨芐西林耐藥。

2.7 16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌穩(wěn)定性研究結(jié)果

16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1、pRmtB2及pRmtB4在無抗生素篩選壓力下，連續(xù)傳3代后的生長(zhǎng)曲線及藥敏試驗(yàn)結(jié)果，由圖5及表3可知，重組菌pRmtB1對(duì)阿米卡星及慶大霉素仍然高度耐藥，其MIC分別為>1 024 μg/mL及512 μg/mL。而pRmtB2及pRmtB4對(duì)阿米卡星及慶大霉素的MIC均為4 μg/mL。

表2 重組菌對(duì)10種藥物的MICs μg/mL

3 分析和討論

表3 RmtB重組菌連續(xù)傳3代以后對(duì)10種藥物的MICs μg/mL

注：“*”表示重組菌pRmtB2和pRmtB4經(jīng)過傳代3次以后對(duì)丁胺卡那霉素和慶大霉素的耐藥性消失。

本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌，并對(duì)重組菌進(jìn)行了穩(wěn)定性研究。結(jié)果表明，16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1比較穩(wěn)定，連傳3代以后對(duì)丁胺卡那霉素及慶大霉素仍然高度耐藥，其MIC分別為>1 024 μg/mL、512 μg/mL。而pRmtB2、pRmtB4傳代的過程中，對(duì)丁胺卡那霉素及慶大霉素的敏感性恢復(fù)，其MIC均為 4 μg/mL。研究結(jié)果表明，16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1穩(wěn)定性較強(qiáng)，可作為16S rRNA甲基化酶耐藥抑制劑篩選模型。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌，穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，16S rRNA甲基化酶RmtB重組菌pRmtB1穩(wěn)定性較強(qiáng)，可作為16S rRNA甲基化酶耐藥抑制劑篩選模型。