張元元 王林婭 張瑞東 林 巍 于皎樂 吳 穎 漆佩靜 范 佳 李 靜 林嘉衍 鄭雪嶺 彭曉霞 蔣 慧 鄭胡鏞

急性早幼粒細胞白血病(APL)是以骨髓中早幼粒細胞增多為特征的髓系白血病，伴有t(15;17)染色體改變及PML/RARα融合基因。臨床上，APL常有嚴重出血傾向，甚至發(fā)生顱內(nèi)出血、彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)而危及生命[1]。三氧化二砷(ATO)聯(lián)合全反式維甲酸(ATRA)治療APL已取得顯著療效，獲得較高的治愈率[2-4]。此外，近年來口服復方黃黛片(RIF)使APL的治療更加簡便和便宜，不僅提高了APL患者的生活質(zhì)量，且減輕了患兒家庭經(jīng)濟負擔[3,5]。盡管砷劑的使用提高了APL的治愈率，但其在兒童APL中應用的安全性尚缺乏相關報道。本研究是建立優(yōu)化中國兒童白血病協(xié)作組-急性早幼粒細胞白血病(CCLG-APL)2016治療方案研究中的一部分，觀察CCLG-APL方案中砷劑應用的有效性及安全性。

1 方法

1.1 倫理和注冊 本研究通過首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的倫理審批(審批號：2016-k-30)，并在中國臨床試驗注冊中心注冊(注冊號：ChiCTR-OIN-17011227)。

1.2 納入標準 ①2016年3月16日至2018年5月1日在我院血液腫瘤中心初診的APL患兒；②采用CCLG-APL 2016方案治療；③治療前患兒監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.3 APL診斷標準及危險度分層

1.3.1 診斷標準 根據(jù)CCLG-APL 2016方案，符合以下條件①+②或①+③即可確診。①骨髓細胞形態(tài)學：AML-M3(FAB分型)；②染色體或FISH：t(15;17)；③分子生物學檢測：PML/RARα陽性。

1.3.2 危險度分層 根據(jù)CCLG-APL 2016方案，依據(jù)外周血WBC計數(shù)和分子生物學檢測情況分為：①低危組：初診WBC<10×109·L-1。②高危組：初診WBC≥10×109·L-1或/和FLT3-ITD突變者；或初評為低危組的患兒在維持治療前PML/RARα融合基因未轉(zhuǎn)陰，或維持期、停藥后基因出現(xiàn)陰轉(zhuǎn)陽，則升級為高危。③超高危組：初始治療前分組為高危組，在維持治療前PML/RARα融合基因沒有轉(zhuǎn)陰的患兒，升級為超高危。

1.4 CCLG-APL 2016治療方案

1.4.1 誘導治療 ①低危組：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～28；ATO 0.15 mg·kg-1·d-1(最大劑量 10 mg·d-1)靜滴，D1～28。②高危組：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～28；ATO 0.15 mg·kg-1·d-1(最大劑量 10 mg·d-1)靜滴，D1～28；蒽環(huán)類藥物[去甲氧柔紅霉素(ID)10 mg·m-2·d-1靜滴qod×2～3次或柔紅霉素(DNR)40 mg·m-2·d-1靜滴qod×2～3次]。

1.4.2 鞏固治療 ①低危組：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～14；RIF 50～60 mg·kg-1·d-1口服，D1～14。②高危組：ATRA 15～25 mg·m-2·d-1口服，D1～14；蒽環(huán)類藥物(ID 10 mg·m-2·d-1靜滴qod×3次或DNR 40 mg·m-2·d-1靜滴qod×3次)。若分子生物學(PML/RARα)不緩解，重復1次。

1.4.3 維持治療 ATRA 15～25 mg·m-2·d-1，口服1周，停1周，依次循環(huán)；RIF 50～60 mg·kg-1·d-1，口服2周，停2周，依次循環(huán)。8周為1個療程，低危組4個療程，高危組5個療程。

1.4.4 中樞神經(jīng)白血病(CNSL)的防治 阿糖胞苷、地塞米松兩聯(lián)鞘內(nèi)注射至少4次，即誘導期1次(務必待DIC控制后)，鞏固治療1次，維持期每3～6個月1次，共2次。對鞏固治療后PML/RARα未轉(zhuǎn)陰、增加1次鞏固治療的患兒，需增加1次兩聯(lián)鞘內(nèi)注射。

1.5 砷濃度檢測 采用等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS，美國Agilent公司，型號7700x)進行砷濃度檢測。

1.5.1 ATO與RIF血、尿監(jiān)測時間 ①誘導緩解期：誘導D0、D7、D14、D28；②緩解后鞏固治療：鞏固D14(鞏固結(jié)束，低危組為砷劑使用第14 d后，高危組為鞏固治療第14 d)；③緩解后維持治療：維持期(維持治療第10周)和維持結(jié)束(停藥時)；④隨訪：停藥后半年、1年、1.5年、2～3年(如果還未降到安全濃度以下，第5年再檢測1次)。

1.5.2 頭發(fā)和指甲砷濃度監(jiān)測時間 誘導D0、誘導D28、停藥時、停藥后半年、1年、2～3年、5年行砷濃度檢測。

1.5.3 砷濃度檢測方法 血、尿標本保存期<2周于4℃保存，>2周于-20℃保存；頭發(fā)和指甲常溫避光保存。①取靜脈血樣品約1.0 mL，加入HNO31.5 mL、H2O20.5 mL，微波消解，以純水定容至15 mL。消化液稀釋4倍后，上機測定。同步制備空白溶液。②尿：準確吸取尿樣品約1.0 mL，加入HNO31.5 mL、H2O20.5 mL，微波消解，以純水定容15 mL。消化液稀釋20倍后，上機測定。同步制備空白溶液。③頭發(fā)和指甲先用0.5%TRITON X-100 浸泡15 min，自來水沖洗10次，去離子水沖洗10次，丙酮和無水乙醇各沖洗1次后，用濾紙包好晾干。準確稱取頭發(fā)、指甲樣品約0.1 g，加入HNO31.5 mL、H2O20.5 mL，微波消解，以純水定容至15 mL。消化液稀釋4倍后，上機測定。同步制備空白溶液。

1.6 砷劑不良反應

1.6.1 短期反應 在治療過程中觀察到的砷劑不良反應，包括過敏反應、胃腸道反應、肝臟毒性、心臟毒性、腎臟毒性、神經(jīng)系統(tǒng)損害。

1.6.2 遠期反應 在維持治療結(jié)束即停藥后的隨訪過程中觀察到的砷劑不良反應，主要包括心血管事件、慢性腎損傷、糖尿病、神經(jīng)機能障礙等。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)(P25，P75)表示。兩兩比較采用秩和檢驗。非正態(tài)分布的雙變量資料采用Spearman秩相關檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 15例初診APL患兒納入本研究，男8例，女7例，發(fā)病年齡3～16(10.4±4.0)歲。所有患兒PML/RARα融合基因均陽性。初評為低危13例，高危2例，其中1例因FLT3-ITD突變、1例因鞏固治療期間(即維持治療前)分子生物學持續(xù)不緩解，升級為高危。初診WBC計數(shù)中位數(shù)為3.61×109·L-1，低、高危組初診WBC計數(shù)中位數(shù)分別為 3.58×109·L-1和11.31×109·L-1。所有患兒在誘導治療第28 d時均獲得骨髓形態(tài)學完全緩解，在進入維持治療前均獲得分子生物學完全緩解。

2.2 砷濃度檢測

2.2.1 血、尿砷濃度 表1顯示，誘導D0患兒血砷中位濃度為0.7 ng·mL-1。血砷濃度在誘導治療D7迅速達到治療有效濃度，在鞏固治療D14達高峰，此后逐漸下降，治療期間44.9～74.6 ng·mL-1。治療期間，血砷濃度除2例患兒在鞏固治療D14分別為 121.3和9.46 ng·mL-1，其他患兒均在10～100 ng·mL-1有效范圍內(nèi)(圖1A)。

表1 在兒童APL砷劑各治療階段不同組織中的砷濃度檢測[中位數(shù)(P25，P75)]

注 N1為在該治療階段檢測的血、尿標本數(shù)，N2為在該治療階段檢測的頭發(fā)、指甲標本數(shù)。因患者的依從性及治療所處階段的不同，各治療階段檢測的標本數(shù)不同。-：未檢測。1例患兒于砷劑停用14 d后檢測血砷濃度，與本研究方案要求的檢測時間點不符，不納入分析

在鞏固治療期間血砷濃度121.3 ng·mL-1的患兒初評為低危，在鞏固治療期間分子生物學持續(xù)不緩解，升級為高危；血砷濃度9.46 ng·mL-1的患兒初評為高危，在鞏固治療期間未使用砷劑。血砷濃度在誘導D0、停藥、停藥半年3組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 1)。兩兩比較，血砷濃度在誘導D0與停藥之間、停藥半年與停藥之間差異均有統(tǒng)計學意義(P分別為0.000 6和0.019 0)，在誘導D0與停藥半年之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.140 1)。

尿砷濃度在鞏固D14達高峰，在停藥后迅速降至正常(表1，圖1B)。尿砷濃度在誘導D0、停藥、停藥半年3組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001 1)。兩兩比較，尿砷濃度在誘導D0與停藥間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002 0)，在停藥半年與誘導D0(P=0.451 9)、停藥(P=0.065 1)之間差異均無統(tǒng)計學意義。

此外，Spearman秩相關分析(圖2A)顯示血砷濃度與尿砷濃度成正相關(r=0.778，P=0.000 0)。

2.2.2 頭發(fā)、指甲砷濃度 如表1所示，頭發(fā)、指甲中砷濃度在停藥時達高峰，在停藥后逐漸下降(圖1C、D)。頭發(fā)砷濃度在誘導D0、停藥、停藥半年3組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 4)。兩兩比較，頭發(fā)砷濃度在誘導D0與停藥之間、停藥半年與停藥之間差異均有統(tǒng)計學意義(P分別為0.000 8和0.042 9)，在停藥半年與誘導D0(P=0.727 2)之間差異無統(tǒng)計學意義。

圖1APL患兒不同治療時期血、尿、頭發(fā)、指甲中的砷濃度情況

注 圖A、圖B中X軸為砷劑檢測時間點，1、2、3、4、5、6、7、8、9分別代表誘導D0、D7、D14、D28、鞏固D14、維持治療、停藥、停藥半年、停藥1年；A：血砷濃度；B：尿砷濃度；C：頭發(fā)砷濃度；D：指甲砷濃度

指甲砷濃度在誘導治療D0、停藥、停藥半年三組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000 9)。兩兩比較，指甲砷濃度在誘導D0與停藥之間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001 5)，停藥半年與誘導D0(P=0.727 2)、停藥(P=0.068)差異無統(tǒng)計學意義。

Spearman秩相關分析顯示，頭發(fā)砷濃度與指甲砷濃度呈正相關(r=0.847，P=0.000 0)(圖2B)。此外，血砷濃度與頭發(fā)(r=0.641，P=0.000 0)、指甲(r=0.655，P=0.000 0)中砷濃度均成正相關。尿砷濃度與頭發(fā)(r=0.622，P=0.000 0)、指甲(r=0.688，P=0.000 0)中砷濃度均呈正相關。

圖2不同組織中砷濃度的相關性

注 A：血砷濃度與尿砷濃度相關性分析；B：頭發(fā)砷濃度與指甲砷濃度相關性分析

2.3 砷劑的不良反應 隨訪1～25.5個月，平均隨訪(12.2±7.8)個月。

2.3.1 砷劑的短期反應 15例患兒均無砷劑使用過敏，無腎臟損害。2例發(fā)生胃腸道反應，表現(xiàn)為惡心、嘔吐，予對癥后好轉(zhuǎn)。7例肝損害，1例心臟損害，表現(xiàn)為肝酶、肌酸激酶同工酶增高，予對癥支持治療后好轉(zhuǎn)。1例在誘導治療第4周出現(xiàn)足拇趾疼痛，2天后自行緩解。1例在誘導期間出現(xiàn)雙下肢麻木，在鞏固期間出現(xiàn)耳鳴，純音測聽提示右耳低頻神經(jīng)性耳聾，將砷劑減量后癥狀消失。1例在維持治療第2周出現(xiàn)易睡、汗多、周身疼，將砷劑減量后癥狀消失。

2.3.2 砷劑的遠期反應 在停藥后的隨訪中，目前尚未觀察到砷劑的慢性不良反應，如心血管事件、慢性腎損傷、糖尿病、神經(jīng)機能障礙等。

3 討論

目前在我國成人APL治療中，ATRA聯(lián)合砷劑治療已寫入2018年版APL診治指南[6]。然而，砷劑應用在兒童APL中的安全性尚缺乏相關報道。砷劑是一種有毒、致癌物質(zhì)[7-9]，被吸收后迅速變?yōu)榱蚧锍林诮M織內(nèi)，主要貯藏于肝、腎、胃腸、脾與肺內(nèi)，極少量貯存在肌肉和神經(jīng)組織中。因此，砷劑的使用可引起嚴重的不良反應，如胃腸道反應、肝功損害、腎衰竭、心律失常等[10,11]，由此說明研究砷劑在兒童APL中安全性的必要性和重要性。

目前臨床上常用的砷劑包括靜脈制劑ATO和口服制劑RIF。ATO對APL細胞發(fā)揮劑量依賴的雙重效應[12]，低濃度(0.1～0.5 μmol·L-1)誘導細胞分化，高濃度(0.5～2 μmol·L-1)誘導細胞凋亡。RIF為中藥復方制劑，成分為雄黃、青黛、太子參、丹參。雄黃的有效成分是四硫化四砷，能夠通過維甲酸受體信號通路降解PML/RARα融合基因誘導細胞凋亡，且口服方便，在治療中無需返院靜脈用藥，可減少住院次數(shù)、縮短住院時間，應用前景較廣泛[13]。在本研究中，除誘導治療期間使用靜脈ATO外，鞏固和維持期間均使用口服RIF，極大地減少了患兒住院次數(shù)，降低了治療費用。本研究在治療各階段檢測了患兒不同組織中的砷濃度發(fā)現(xiàn)，無論是使用靜脈ATO還是口服RIF，除2例血砷濃度在鞏固治療第14 d檢測分別為 121.3 ng·mL-1、9.46 ng·mL-1，所有患兒在治療階段的血砷濃度均可維持在治療有效濃度范圍內(nèi)(10～100)ng·mL-1，且血、尿砷濃度在停藥半年后迅速降至正常水平，頭發(fā)、指甲中砷濃度在停藥時達高峰，在停藥后逐漸下降，停藥半年后降至治療前水平。這與既往報道的成人APL患者在ATO停藥后，血、尿砷濃度在停藥后0～6個月迅速降至正常，頭發(fā)和指甲中的砷濃度在停藥6個月后降至正常穩(wěn)態(tài)水平相符[2]。本研究結(jié)果顯示，指甲中砷濃度在停藥1年時較停藥半年高，這可能與停藥半年和停藥1年時所檢測的標本較少有關，未來需長期隨訪、加大樣本量進行分析。

因血砷半衰期短，大部分砷的代謝物在3～4 d內(nèi)經(jīng)尿液排泄出體內(nèi)，故血、尿砷通常被作為短期暴露的標記物[14,15]。由于頭發(fā)和指甲中富含半胱氨酸角蛋白，砷對半胱氨酸的高親和力促進砷在頭發(fā)和指甲中的蓄積，通常需2～12個月排泄出體內(nèi)，因此頭發(fā)和指甲通常作為長期暴露的標記物[15,16]。此外，頭發(fā)和指甲中的砷濃度與其他組織中的砷濃度相關性良好(如尿液和血液)[17,18]，這與本研究結(jié)果相符。在本研究中，血、尿、頭發(fā)、指甲中的砷濃度均互相成正相關性，且隨著砷劑使用時間的延長，頭發(fā)、指甲中蓄積的砷含量逐漸增加，在停藥時到達高峰，在停藥后逐漸降至治療前水平，提示頭發(fā)和指甲可作為砷長期暴露標記物。

砷劑的不良反應包括短期反應和遠期反應。在本研究中觀察到的短期反應包括胃腸道反應、肝損害、心臟損害、神經(jīng)系統(tǒng)損害，在減少藥物劑量及對癥支持治療后均好轉(zhuǎn)。本研究最長隨訪時間達25.5月，平均隨訪時間(12.2±7.8)月，目前尚未觀察到慢性砷中毒的常見癥狀，如心血管事件、慢性腎損傷、糖尿病、神經(jīng)機能障礙等。但本研究時間尚短，仍需長期動態(tài)觀察及檢測。

致謝：感謝北京大學人民醫(yī)院主鴻鵠大夫?qū)Ρ狙芯康闹笇?，感謝北京大學醫(yī)學部解清老師對砷濃度檢測的技術幫助。