楚琰 ，李沛，楊光, ，趙換維，王雅臺(tái)，戴建國(guó)，朱介法，孫健勇

（1.西安海棠職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教研室，陜西 西安 710038； 2.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 胸腔外科，陜西 西安，710038；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院 消化外科，陜西 西安，710032）

結(jié)腸癌（colon cancer）是常見的惡性消化道腫瘤之一，全球病死率逐年上升，而腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是致死的重要原因[1]，其發(fā)生、發(fā)展涉及多種基因以及蛋白質(zhì)分子調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，對(duì)此過(guò)程中異常表達(dá)的分子進(jìn)行研究可能發(fā)現(xiàn)癌癥發(fā)生的分子機(jī)制及新的治療靶點(diǎn)故生物治療可能成為治療結(jié)腸癌的突破點(diǎn)。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性單鏈非編碼小RNA，通過(guò)與mRNA的3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA翻譯或直接使其降解，抑制靶基因的表達(dá)[2]。最近有多項(xiàng)研究結(jié)果證實(shí)，miRNA的異常表達(dá)在眾多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。

2007年，Mishima等[3]研究了小鼠中樞神經(jīng)中miR-124的表達(dá)，從此拉開了miR-124的研究序幕。有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在不同腫瘤中的表達(dá)異常，并影響腫瘤的生物學(xué)行為。Zhao等[4]在對(duì)頭頸部鱗癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-124的表達(dá)量比正常組織低4倍多，而在升高JHU-22細(xì)胞中miR-124的表達(dá)后，可以發(fā)現(xiàn)miR-124可以通過(guò)抑制靶基因SphK1進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。另外miR-124被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中低表達(dá)[5]，并誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和凋亡，并證實(shí)了miR-124的抑癌作用。目前關(guān)于miR-124與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其機(jī)制尚不完全清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)miR-124在結(jié)腸癌的表達(dá)情況，并調(diào)節(jié)miR-124的表達(dá)來(lái)觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其內(nèi)在機(jī)制。

miRNA常常通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶分子來(lái)對(duì)腫瘤的惡性進(jìn)展發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。整合素β1（integrin β1，ITGB1）是一種重要黏附分子，其在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到了重要作用。ITGB1是介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的主要受體，在細(xì)胞增殖、黏附和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是腫瘤發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)分子，有研究[6-8]表明其與miRNA表達(dá)調(diào)控有關(guān)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如果在結(jié)腸癌進(jìn)展中能將ITGB1作為miRNA調(diào)控的靶基因，將對(duì)腫瘤的臨床靶向治療提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

結(jié)腸癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織來(lái)源于2014年—2015年空軍軍醫(yī)大學(xué)西京消化病醫(yī)院收治的結(jié)腸癌手術(shù)患者，共40例患者，40對(duì)樣本（男20例，女20例；年齡區(qū)間24～79歲，中位年齡63歲），術(shù)后對(duì)組織標(biāo)本參照AJCC/UICC的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷、分級(jí)及分期。TNM分期：I期7例，II期20例，III期9例，IV期4例。腫瘤大小：≥5 cm 26例，＜5 cm 14例。組織學(xué)分化程度：高分化及中分化組28例，中低分化組6例，低分化組6例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性者22例，陰性18例。癌組織均取自于腫瘤中心非液化壞死區(qū)，癌旁正常組織取自距腫瘤＞5 cm的部位，所有組織經(jīng)病理證實(shí)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會(huì)同意；胃黏膜上皮來(lái)源的永生化細(xì)胞GES、結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、SW480、Lovo及HEK-293T細(xì)胞由空軍軍醫(yī)大學(xué)腫瘤生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；TRIzol及Lipofectamine 2000試劑購(gòu)自Invitrogen公司；miR-124 qRT-PCR引物試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Reverse Transcription Kit購(gòu)自Qiagen公司，實(shí)時(shí)定量PCR試劑SYBR Green Real-time PCR Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司；LvmiR-124、LV-luc、Lv-shITGB1、Lv-shEGFP慢病毒質(zhì)粒由我校生化教研室饋贈(zèng)；AnnexinV-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自珠海健康元生物醫(yī)藥有限公司；BALB/C裸鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；雙熒光素酶報(bào)告基因載體購(gòu)自Promega公司；miR-124模擬物及陰性對(duì)照序列購(gòu)自上海吉瑪公司；Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System購(gòu)自ABI公司，β-actin、ITGB1抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司。

1.2 方法

1.2.1 組織及細(xì)胞RNA提取 按TRIzol試劑說(shuō)明書提取結(jié)腸癌組織或結(jié)腸癌細(xì)胞株的總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量總RNA濃度及A260/280比值，取比值為1.8～2.0之間的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μg總 RNA，按miScript Reverse Transcription Kit說(shuō)明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)miR-124在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及miR-124在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的感染效率（以U6做內(nèi)參）。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性 95 ℃ 10 s，退火 56 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 15 s，共45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5min終止反應(yīng)。所有反應(yīng)均設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，用-ΔCt值表示miR-124的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR結(jié)果采用 2-△△Ct法表示。miR-124 引物序列：TAA GGC ACG CTG AAT GCC GG。ITGB1序列正向：TTT TGA GCT CGT ACT GCC CGT GCA AAT CCC ACA A；反向：TTT TAC GCG TTG CTT TTC CTC AAC TTC TTT AA。GAPDH序列正向：AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG； 反 向：AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及感染、轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞株Lovo 48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入終濃度為8 μg/mL的病毒液感染細(xì)胞。篩選4周后得到穩(wěn)定表達(dá)miR-124的結(jié)腸癌細(xì)胞株、低表達(dá)ITGB1的結(jié)腸癌細(xì)胞株和陰性對(duì)照LV-luc及Lv-shEGFP細(xì)胞株。結(jié)腸癌細(xì)胞株用含10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按說(shuō)明書用Lipofectamine 2000將miR-124模擬物/陰性對(duì)照序列及WT-ITGB1-3'UTR、Mut-ITGB1-3'UTR-1、Mut-ITGB1-3'UTR-2、Mut-ITGB1-3'UTR-1-2及參照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞株。

1.2.4 凋亡實(shí)驗(yàn) 在建立穩(wěn)定高表達(dá)miR-124或低表達(dá)ITGB1細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，將結(jié)腸癌細(xì)胞懸浮培養(yǎng)于PolyHEMA板中，收集細(xì)胞，按凋亡檢測(cè)試劑盒加入相應(yīng)試劑，移液器輕輕吹打混勻，室溫下避光放置10 min，使用流式細(xì)胞儀定量觀察miR-124或ITGB1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抗脫落凋亡（轉(zhuǎn)移）敏感性能力的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 在48孔板中用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)HEK-293T細(xì)胞，當(dāng)長(zhǎng)滿至80%～90%時(shí)，將miR124模擬物/陰性對(duì)照序列分別與WT-ITGB1-3'UTR/Mut-ITGB1-3'UTR-1/Mut-ITGB1-3'UTR-2/Mut-ITGB1-3'UTR-1-2及pRL-TK參照質(zhì)粒用Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染HEK-293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后用Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System分 析Firefly及Renilla熒光強(qiáng)度。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將不同表達(dá)miR-124的結(jié)腸癌細(xì)胞株用PBS沖洗，加入RIPA裂解液，吹打，冰上裂解后收集裂解液，離心后收集上清液，與上揚(yáng)緩沖液共同煮沸20 min，每孔上樣10 μL后用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，4 ℃一抗孵育過(guò)夜，PBST洗膜后二抗孵育2 h，洗膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，暗室內(nèi)壓片曝光。

1.2.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用裸鼠5～7周齡，雌性20只，用PBS重懸對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定表達(dá)miR-124/低表達(dá)ITGB1和表達(dá)陰性對(duì)照LV-luc/Lovo-Lv-shEGFP的Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞亞株。將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×103/mL，采用尾靜脈注射的方法將細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)。觀察裸鼠肺表面結(jié)節(jié)直徑＞0.5 mm轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，并取裸鼠肺臟組織進(jìn)行HE染色。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)由重復(fù)性3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得出，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件及Graph Prism 5.0對(duì)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異用單因素方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-124在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床參數(shù)的關(guān)系

在40對(duì)結(jié)腸癌及其配對(duì)癌旁組織中，miR-124在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)均值明顯低于癌旁組織（1.48 vs.2.58，P＜0.05）（圖1）。結(jié)腸癌組織中miR124表達(dá)量升高的15例，表達(dá)量降低的25例，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，miR-124在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)（均P＜0.05）（表1）。

圖1 miR-124在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 Expressions of miR-124 in colon cancer and adjacent tissues

表1 miR-124表達(dá)與患者臨床因素的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of miR-124 expression with the clinical factors of the patients [n (%)]

2.2 miR-124在結(jié)腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

進(jìn)一步在GES、HT29、SW480和Lovo細(xì)胞系中利用qRT-PCR的方法分析內(nèi)源性miR-124表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，miR-124在各結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)水平均明顯低于GES細(xì)胞（均P＜0.05），且隨著癌細(xì)胞惡性程度的增加，miR-124的表達(dá)逐漸降低（GES＞HT-29＞SW480＞Lovo）。其相對(duì)Ct值分別為：5.978±0.531、3.023±0.401、1.211±0.190、1.000±0.07（圖2）。

圖2 miR-124在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平Figure 2 Expressions of miR-124 in colon cancer cells

2.3 miR-124過(guò)表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞株的建立

用慢病毒感染的方法用LV-miR-124及對(duì)照LV-luc病毒分別感染結(jié)腸癌細(xì)胞株，并采用Blasticidin進(jìn)行藥物壓力篩選。結(jié)果顯示：LV-miR-124明顯上調(diào)了Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞miR-124的表達(dá)（圖3），從而獲得了穩(wěn)定高表達(dá)miR-124的結(jié)腸癌細(xì)胞株。

圖3 轉(zhuǎn)染miR-124模擬物后結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-124的表達(dá)水平Figure 3 The miR-124 expression level in colon cancer cells after transfection of miR-124 mimics

2.4 miR-124過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

用Annexin-V染色結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)定量觀察發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-124的Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)36 h后的凋亡細(xì)胞比例從對(duì)照組（LV-luc）的（1.5±0.69）%升高至（16.6±7.28）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 miR-124對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 The influence of miR-124 on apoptosis in colorectal cancer cells

2.5 結(jié)腸癌細(xì)胞中ITGB1與miR-124的關(guān)系

根據(jù)miRNA預(yù)測(cè)軟件miRBase（http://www.mirbase.org）預(yù)測(cè)分析，有2個(gè)與miR-124互補(bǔ)識(shí)別的可能結(jié)合位點(diǎn)（圖5A-B）。故克隆了包含該識(shí)別區(qū)域在內(nèi)的DNA片段，建立了針對(duì)此3'UTR序列的報(bào)告基因系統(tǒng)，在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)。結(jié)果顯示：利用化學(xué)合成的miR-124模擬物轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，可明顯抑制野生型ITGB1-3'UTR報(bào)告基因的活性。但對(duì)miR-124結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變的3種突變體報(bào)告基因的熒光素酶活性的調(diào)節(jié)能力均有不同程度的減弱。提示ITGB1可能是miR-124的靶基因（圖5C）。并通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，ITGB1是miR-124的靶基因（圖5D）。

圖5 miR-124靶基因預(yù)測(cè)與鑒定 A：miR-124的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；B：ITGB1 3'UTR報(bào)告基因的設(shè)計(jì)；C：雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果；D：ITGB1的表達(dá)變化Figure 5 Prediction and identification of the target genes for miR-124 A: The predicted targets of miR-124; B: Design of the ITGB1 3’UTR reporter gene; C: Results of dual luciferase reporter assay; D: Change in ITGB1 expression

2.6 miR-124對(duì)小鼠結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移與生存期的影響

尾靜脈注射結(jié)腸癌細(xì)胞20 d后取裸鼠肺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)移灶計(jì)數(shù)，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，LV-luc組裸鼠肺臟中有明顯的肺轉(zhuǎn)移灶生成，而LV-miR-124組裸鼠肺臟中卻很少能夠觀察到明顯的肺轉(zhuǎn)移灶。注射LV-luc細(xì)胞的裸鼠絕大多數(shù)都出現(xiàn)肺臟的轉(zhuǎn)移（7/10），而注射LV-miR-124細(xì)胞的裸鼠卻幾乎沒有形成轉(zhuǎn)移灶（1/10）。而病理切片的結(jié)果顯示，注射參照細(xì)胞LV-luc細(xì)胞的裸鼠肺組織切片染色顯示腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)成團(tuán)分布，并侵潤(rùn)肺組織，而注射LV-miR-124細(xì)胞的裸鼠肺組織切片染色顯示并未發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤細(xì)胞分布及侵潤(rùn)（圖6A）。轉(zhuǎn)移灶數(shù)分別為（44.3±13.52）個(gè)、（13.9±4.72）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6B）。

為更進(jìn)一步明確miR-124對(duì)荷瘤小鼠生存的影響，對(duì)尾靜脈注射結(jié)腸癌細(xì)胞的小鼠進(jìn)行了生存時(shí)間的記錄。結(jié)果顯示miR-124高表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞組小鼠的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（P＜0.05）（圖6C）。

圖6 miR-124對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞小鼠肺轉(zhuǎn)移及生存的影響 A：顯微鏡下觀察（HE×200）；B：肺轉(zhuǎn)移灶比較；C：生存時(shí)間比較Figure 6 The influence of miR-124 on pulmonary metastasis and survival in nude mice A: Views under microscopes (HE×200);B: Comparison of the pulmonary metastases; C: Comparison of the survival times

2.7 ITGB1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡及小鼠結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移與生存期的影響

采用慢病毒感染的方法將ITGB1低表達(dá)組LV-shITGB1及對(duì)照LV-shEGFP慢病毒分別感染Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞，并使用Puromucin進(jìn)行藥物壓力篩選。qRT-PCR結(jié)果如圖所示：與LV-shEGFP比較，LV-shITGB1明顯抑制了Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源ITGB1的表達(dá)水平（P＜0.05）（圖7），從而獲得了穩(wěn)定低表達(dá)ITGB1的結(jié)腸癌細(xì)胞亞株。

在建立低表達(dá)ITGB1穩(wěn)定細(xì)胞亞株的基礎(chǔ)上，利用PolyHEMA包被培養(yǎng)板，將細(xì)胞種入其中，建立了結(jié)腸癌細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)模型。使用Annexin-V染色結(jié)合流式細(xì)胞分析技術(shù)定量觀察低表達(dá)ITGB1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞抗脫落凋亡敏感性能力的影響。結(jié)果顯示低表達(dá)ITGB1的Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞在懸浮培養(yǎng)36 h后的凋亡細(xì)胞比例明顯升高[（1.3±0.65）%vs.（10.8±5.47）%，P＜0.05]（圖8）。

在進(jìn)行尾靜脈注射20 d后取小鼠肺臟組織進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)Lovo-LV-shEGFP組小鼠肺臟中有明顯的肺轉(zhuǎn)移灶生成，而Lovo-LV-shITGB1組小鼠肺臟中卻只有克隆較小的肺轉(zhuǎn)移灶。轉(zhuǎn)移灶數(shù)分別為（54.8±17.84）個(gè)vs.（14.4±4.70）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖9A-B）。ITGB1低表達(dá)Lovo結(jié)腸癌細(xì)胞注射組小鼠的生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于對(duì)照組（圖9C）。

圖7 轉(zhuǎn)染ITGB1 shRNA后結(jié)腸癌細(xì)胞ITGB1的表達(dá)水平Figure 7 The ITGB1 expression level in colon cancer cells after transfection of ITGB1 shRNA

圖8 ITGB1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 8 The influence of ITGB1 on apoptosis in colorectal cancer cells

圖9 ITGB1對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞小鼠肺轉(zhuǎn)移及生存的影響 A：顯微鏡下觀察（HE×200）；B：肺轉(zhuǎn)移灶比較；C：生存時(shí)間比較Figure 9 The influence of ITGB1 on pulmonary metastasis and survival in nude mice A: Views under microscopes (HE×200);B: Comparison of the pulmonary metastases; C: Comparison of the survival times

2.8 miR-124與ITGB1表達(dá)的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步明確miR-124與潛在靶基因ITGB1在結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展進(jìn)程中的聯(lián)系，分析了所收集結(jié)腸癌組織樣本中miR-124與ITGB1在RNA水平的表達(dá)相關(guān)性。結(jié)果如圖所示：miR-124與ITGB1呈負(fù)相關(guān)（r=-0.4936，P=0.002）（圖10）。

圖10 miR124與ITGB1表達(dá)的相關(guān)性Figure 10 Correlation between miR124 and ITGB1 expressions

3 討 論

3.1 miRNA與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制研究

結(jié)腸癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，其致死性高、預(yù)后差，腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是致死的重要原因[9]。腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移過(guò)程極其復(fù)雜，牽涉多種分子生物學(xué)機(jī)制。而近年來(lái)生物治療成為了治療腫瘤的重要突破口，因此，尋找其治療靶點(diǎn)對(duì)治療結(jié)腸癌具有重要意義。

在腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中，癌基因及抑癌基因均起到調(diào)節(jié)作用，越來(lái)越多的人類miRNA 被發(fā)現(xiàn)證實(shí)與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著致癌或抑癌的作用。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)道，miRNA-124在人類疾病中扮演著重要的角色，其與兒童潰瘍性結(jié)腸炎[10]、阿爾茲海默癥[11-12]以及多種惡性腫瘤[4,13-15]關(guān)系密切。有報(bào)道[16]發(fā)現(xiàn)miR-124在結(jié)腸癌中低表達(dá)，并調(diào)控結(jié)腸癌的放療敏感性；另有研究[17]報(bào)道，miR-124在結(jié)腸癌中靶向抑制ROCK1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。而miRNA的靶基因眾多，目前miRNA對(duì)結(jié)腸癌生物學(xué)行為的影響機(jī)制并不十分明確。因此，對(duì)miRNA-124影響結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探討。

3.2 miR124以往及本研究的成果

與之前關(guān)于miR-124的研究報(bào)道結(jié)果類似，本研究發(fā)現(xiàn)miR-124在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平下降，另外，發(fā)現(xiàn)miR-124在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移分類有關(guān)。而以上結(jié)果與miR-124在胃癌中發(fā)現(xiàn)的情況相似[18]。為了研究miR-124對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究構(gòu)建了過(guò)表達(dá)miR-124慢病毒系統(tǒng)，經(jīng)過(guò)感染的結(jié)腸癌細(xì)胞miR-124表達(dá)量提高了500多倍。通過(guò)結(jié)腸癌細(xì)胞懸浮培養(yǎng)模型結(jié)合流式細(xì)胞儀的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-124可以顯著影響結(jié)腸癌細(xì)胞的抗脫落凋亡的敏感性，即促進(jìn)離巢結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。有理由認(rèn)為miR-124調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的抗脫落凋亡的敏感性可能是其抑制結(jié)腸癌遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移灶形成的重要原因之一，進(jìn)而削弱腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。本研究通過(guò)裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-124抑制裸鼠結(jié)腸癌的肺轉(zhuǎn)移并可以延長(zhǎng)裸鼠的生存時(shí)間。但miR-124通過(guò)何種機(jī)制來(lái)調(diào)控靶基因來(lái)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，都需要進(jìn)一步的深入研究。

在以往的研究中，miR-124被發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)抑制其靶基因STAT3[19-20]、KITENIN[21]、GATA6[22]及capn4[23]來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。而miR-124在結(jié)腸癌中是否還通過(guò)其他靶基因影響來(lái)侵襲轉(zhuǎn)移能力尚不清楚。經(jīng)過(guò)軟件預(yù)測(cè)分析，miR-124的靶基因可能是ITGB1，ITGB1作為一種重要的黏附分子在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演著重要作用[24]。在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-124與ITGB1 mRNA的表達(dá)水平成顯著負(fù)相關(guān)，并通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)ITGB1是miR-124的直接靶基因。在設(shè)計(jì)的ITGB1低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)ITGB1的下調(diào)可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的脫落凋亡敏感性，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移，而這與miR-124對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響基本一致。

3.3 基于miR124研究的臨床應(yīng)用前景

miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、腫瘤轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，其研究成果可能對(duì)腫瘤治療產(chǎn)生重要作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-124在結(jié)腸癌中低表達(dá)，并與腫瘤大小、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移分類有關(guān)，miR-124在結(jié)腸癌細(xì)胞中扮演著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的角色，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其是通過(guò)抑制靶基因ITGB1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這為下一步研究結(jié)腸癌中miR-124影響結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的研究建立了細(xì)胞模型，并為如何將miR-124應(yīng)用于臨床治療提供了依據(jù)，為治療結(jié)腸癌及控制復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的治療方法做出了一些探索。