陳忠勝，羅義琳，李梁和，田斌，鄭璐，田甜，余蕾, ，廖欣，詹瑋,

（貴州醫(yī)科大學 1.研究生院 2.病理生理學教研室，貴州 貴陽 550004；3.貴州省婦幼保健醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽550004；貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 4.影像科 5.普通外科，貴州 貴陽 550004）

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，隨著人口老齡化、遺傳、生活方式（如喝酒、吸煙、飲食等）以及環(huán)境的改變，結直腸癌的高發(fā)病率居高不下，目前，我國結直腸癌的發(fā)病率位居全部惡性腫瘤的前三，其病死率也高達第4位[1]。據(jù)2015年一項流行病學數(shù)據(jù)顯示，盡管腫瘤的根治性切除的改進，增加了患者的5年生存率，我國結直腸癌病死率高達50%以上[1-2]。而結直腸癌是一種具有高度特異性的惡性腫瘤，其在臨床病理特征、組織形態(tài)、免疫表型、治療效果以及生物學行為等方面存在較大差異，腫瘤的轉移和復發(fā)仍然是患者重要的死亡原因[3-4]。

組蛋白修飾在疾病的研究中備受關注，其中組蛋白甲基化修飾及乙?；揎椩谀[瘤方面的研究更為常見。組蛋白乙酰化修飾可影響細胞內(nèi)染色質(zhì)的結構，從而參與了相應位點的基因轉錄及調(diào)控，在腫瘤細胞生長和分化過程中起重要作用。因此，本實驗著重觀察結腸癌細胞株SW480及結腸癌組織中組蛋白乙?；揎椀南鄳稽c的變化情況，以期了解組蛋白乙?；揎椩诮Y腸癌中的修飾情況，為后續(xù)進一步的有關結腸癌在組蛋白乙?；揎椃矫娓钊氲难芯孔龊们捌趯嶒灮A。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人正常結腸上皮細胞株NCM460及人結腸癌細胞株SW480均購于上海歌凡生物科技有限公司。使用NCCN指南中關于結腸癌的診斷標準，通過腹部增強CT、腸鏡及病理活檢選取了10例明確診斷為無遠處轉移結腸癌的可行手術治療的患者，取出患者手術切下的腸段，分別選取正常結腸組織及結腸腫瘤組織（均通過病理檢測證實）。

1.2 主要試劑

胎牛血清購自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；DNaseⅠ、彩虹Marker購自Solarbio；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Alexa Fluor488標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、DyLight549標記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術有限公司；E-Plate檢測板購于埃森生物（杭州）有限公司，acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體均購自Abcam公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清及含青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于5%、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期換液傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.2 提取細胞核及核蛋白制備 將細胞及組織利用核漿分離技術提取目的核蛋白。按每1×106個細胞加入裂解液100 μL核蛋白酶抑制劑1 μL的比例冰上裂解30 min，1 200 r/min低溫離心10 min，提取細胞的核蛋白，-80 ℃保存。

1.3.3 組織標本處理 將選取的正常結腸組織及結腸腫瘤組織，用EP管分裝，存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.4 Western blot分析組蛋白乙?；癄顟B(tài) 將提取的細胞及組織的核蛋白，以100 g/L或120 g/L的SDS-PAGE分離，濕法電轉移法轉膜，室溫下?lián)u床封閉1 h，加入不同濃度的一抗（組蛋白乙?；揎椢稽c acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27抗體1:1 000，H3抗體1:400），4 ℃過夜，TBS洗滌液洗膜后分別放入用TBS按1:1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗以及羊抗鼠二抗，室溫下?lián)u床作用1 h，TBS洗滌液洗膜后化學發(fā)光法顯色，X線片曝光，以H3為內(nèi)參照。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Western blot法檢測正常結腸上皮細胞與結腸癌細胞組蛋白乙?；揎椝?/h3>

使用Western blot檢測NCM460與SW480細胞的acH3K9、acH3K14、acH3K18乙酰化修飾水平。結果顯示，與NCM460比較，SW480細胞組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平明均顯下調(diào)（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 Western blot法檢測腸癌患者手術標本中乙酰化修飾水平

使用Western blot法檢測腸癌患者手術切除的腫瘤腸段組織和同一腸癌患者手術切除后非腫瘤腸段組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27乙酰化水平進行檢測，與正常結腸上皮組織相比，結腸癌組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾水平均明顯下調(diào)（均P＜0.05）（圖2）。

3 討 論

結直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，但其發(fā)病機制仍不明確，因腫瘤的早期癥狀不明顯，大部分腫瘤患者確診時已處于中晚期，盡管以根治性切除為主的治療方法已經(jīng)很大程度上延長了患者的生存期，但其晚期轉移和復發(fā)仍然是結直腸癌患者死亡的重要原因[5]。

近年來，表觀遺傳學的研究逐漸被認為與腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要的因素之一[6]，表觀遺傳是指不通過改變DNA序列就能影響基因表達的、可以遺傳的遺傳修飾方式，而組蛋白修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等[7-8]，這些修飾的程度與狀態(tài)決定著基因是否表達[7]。有研究[9]發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；诩膊〉陌l(fā)生發(fā)展中起著重要的意義，而其中H3K9乙?；切揎椈蜣D錄調(diào)控的重要機制。組蛋白乙?；揎椂嘣贖3賴氨酸殘基上的9、14、18、23位點和H4精氨酸殘基上的5、8、12、16位點，而這些位點可激活基因也可沉默基因[10-11]。組蛋白乙?；揎検峭ㄟ^組蛋白乙酰基轉移酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）聯(lián)合調(diào)控，取決于HAT和HDAC的動態(tài)平衡[12]。組蛋白的尾部有多種化學修飾作用，這些修飾可以影響基因的表達（例如：H3和H4發(fā)生乙?；笥欣诩せ罨蜣D錄，而H3K9發(fā)生甲基化后可以抑制基因轉錄）[13]。組蛋白乙酰化轉移酶的主要功能是對核心組蛋白N端25～40個氨基酸范圍內(nèi)的賴氨酸進行乙?；揎棧琀AT將乙酰輔酶A上的乙?；D移到組蛋白N端賴氨酸的ε-氨基上，從而中和了其正電荷，增加了疏水性，削弱了DNA與組蛋白的相互作用，有利于轉錄因子與DNA的結合，促進轉錄[14]。

近年的研究[15]顯示，腫瘤的發(fā)生不僅與DNA甲基化有關，同樣的，組蛋白乙酰化也是參與其中。有研究[16]發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；毕菰诩毙园籽〉陌l(fā)病中起著重要的作用，也有相關報道[17]證實正常乳腺組織中乙酰化的組蛋白H3、H4的表達均較乳腺癌高。關于組蛋白乙?；谀c癌中的修飾表達，國外已有相關的報道[18]顯示：組蛋白的異常乙?；c結直腸癌的發(fā)病有關。

本實驗的研究結果發(fā)現(xiàn)：與NCM460相比，SW480細胞組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾下調(diào)；與正常結腸上皮組織相比，結腸癌組織的組蛋白acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾下調(diào)。有學者[19]研究證實：在結直腸癌與其他腫瘤中，組蛋白乙酰化降低；然而，對特定部位的檢查表明，乙酰化可以上調(diào)或下調(diào)。而Fraga等[20]使用Western blot分析發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌細胞系H4K16中出現(xiàn)乙酰化降低，而在未分化結腸腺癌中觀察到H4K12和H3K18的低乙酰化，在分化良好的結直腸腫瘤中，其乙?；揎棾潭仍黾覽21]。與這些發(fā)現(xiàn)相反，H3K9的低乙?；癄顟B(tài)與腫瘤組織學類型呈正相關，在分化良好的腫瘤中觀察到H3K9Ac乙酰化水平降低[22]。在其他實體腫瘤中，即肺腺癌和鱗狀細胞癌，H3K27乙?；脑黾釉谀[瘤部分比在相應的基質(zhì)中更明顯[23]。在前期有關肝癌中組蛋白乙?；揎椝揭渤霈F(xiàn)了類似的變化[24]。因此，后續(xù)的實驗研究將更深入的研究組蛋白乙酰化修飾在結腸癌中體內(nèi)及體外實驗其染色質(zhì)免疫共沉淀等相關實驗，以期組蛋白乙?；揎椩诮Y腸癌中的機制。