張倩倩 劉康泰 韓宗晟 李榮貴

（1. 青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青島 266071；2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100005）

中東呼吸綜合征（Middle East respiratory syndrome，MERS）是一種新型的冠狀病毒引發(fā)的急性、高致命性的呼吸道傳染性疾病。中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-Co V）能夠感染人類和動(dòng)物，引發(fā)呼吸道感染，伴發(fā)多器官功能衰竭等一系列疾?。?］。該病毒于2012年首次在中東沙特阿拉伯地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，2013年世界衛(wèi)生組織（WHO）命名該種傳染性疾病為“中東呼吸綜合征”（MERS）［2-3］。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)資料顯示，自2012 年發(fā)現(xiàn)MERS-Co V 至今，全球檢測(cè)出MERS-Co V 病毒感染的病例與日趨增，且致死率極高。病例主要集中在中東地區(qū)，但在西亞、歐洲、非洲和北美洲等地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，病史記錄表明中東地區(qū)以外國(guó)家報(bào)告的原發(fā)病例均有與中東通過(guò)商務(wù)、宗教、旅游等不同形式的密切交流史［4］。蝙蝠可能是MERS-Co V的天然儲(chǔ)庫(kù)，并在傳播中起關(guān)鍵作用［5-6］。另外，根據(jù)研究報(bào)道，駱駝也是MERS-Co V的重要儲(chǔ)庫(kù)寄主，它們似乎是導(dǎo)致人類感染的唯一動(dòng)物宿主［7］。

MERS-Co V 是由一條正鏈 RNA 組成、具有包膜的β 型冠狀病毒，其基因組全長(zhǎng)30 kb，編碼多種結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白［8］。其中刺突蛋白（Spike，S）是病毒表面重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在侵染靶細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。MERS-Co V的S蛋白是I型跨膜糖蛋白，包含1 353個(gè)氨基酸殘基，主要由S1亞基和S2亞基構(gòu)成，并以三聚體狀態(tài)呈現(xiàn)在病毒表面。MERS-Co V利用二肽基肽4（ Dipeptidyl peptidase-4，DPP4，也稱為CD26）作為其在宿主細(xì)胞上的受體［9-10］。MERS-Co V S1亞 基 的 C 端 含 有 結(jié) 合DPP4的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Receptor binding domain，RBD），功能是與受體結(jié)合和識(shí)別后，介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合［11-14］。S蛋白質(zhì)、S1亞基及S2亞基均是可作為MERS-Co V疫苗研究的主要對(duì)象［13］。

現(xiàn)今，尚無(wú)臨床驗(yàn)證有效的抗MERS-Co V的疫苗和治療藥物。大多數(shù)的疫苗和藥物研究仍還只停留在實(shí)驗(yàn)室階段或動(dòng)物試驗(yàn)階段，其主要原因是目前對(duì)中東呼吸綜合征病毒的傳播途徑和致病性尚未明了，且該病毒的高致病性和危險(xiǎn)性，使得人類臨床試驗(yàn)較難開展。因此，高效抗體的研制，對(duì)于中東呼吸綜合征病毒的預(yù)防和控制具有至關(guān)重要的作用。本研究意在克隆MERS-Co V表面刺突S蛋白S1亞基基因，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體，獲得S1-Fc重組融合蛋白，分別通過(guò)克隆了S1亞基基因的重組質(zhì)粒接種，重組S1-Fc融合蛋白接種以及重組質(zhì)粒和重組S1-Fc融合蛋白聯(lián)合接種小鼠，以檢測(cè)小鼠是否發(fā)生免疫反應(yīng)，并檢測(cè)接種小鼠產(chǎn)生的抗S1血清滴度是否存在區(qū)別，為研制預(yù)防中東呼吸綜合征病毒的疫苗提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人胚腎細(xì)胞（HEK293E）（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心）。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒 大腸桿菌感受態(tài)（DH5α），購(gòu)于北京天根有限公司；Peak13CD5LTEVhIgGFc（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所蔣澄宇課題組提供）；pcDNA3.1（+）-S質(zhì)粒（蘇州泓迅生物科技有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6-8周齡雌性BALB /C小鼠（編號(hào)：ACUC-A02-2017-008，北京藥品生物制品鑒定所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心）。

1.1.4 試劑耗材 IgG Fc抗體，細(xì)胞篩選抗性抗生素Puromycin，弗氏完全佐劑（Sigma公司）；山羊抗小鼠二抗（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；限制性內(nèi)切酶NheI、BamH I、AvrII，T4 DNA 連接酶（New Englan BioLabs公司）；Protein A蛋白柱（GE醫(yī)療集團(tuán)）；0.45 μm多孔濾膜（Millipore公司）；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（天根生化科技有限公司）；1×TMB ELISA Substrate Solution（R&D Systems）；5 mL EDTA抗凝采血管（BD公司）；Opti-MEM?I Reduced Serum Medium（1X）liquid（cat. no. 31985-062），DMEM液體培養(yǎng)基，胎牛血清（Invitrogen公司）；脂質(zhì)體NeofectTMDNA transfection reagent（零客創(chuàng)智北京生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒的構(gòu)建 MERS Co V表面刺突蛋白（S）基因來(lái)源于從NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)（登錄號(hào)：KF961222.1），共編碼1 353個(gè)氨基酸，S1為S蛋白的亞基，共編碼751個(gè)氨基酸。首先通過(guò)替換高頻密碼子的方法進(jìn)行序列優(yōu)化，再用次高頻密碼子替換序列中間可能出現(xiàn)的NheⅠ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ及NotⅠ酶切位點(diǎn)；最后將S基因的核苷酸序列的前后兩端連接上NheⅠ、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ及NotⅠ 酶切位點(diǎn)，由蘇州泓迅生物科技有限公司合成。將合成的S基因作為模板，采用PCR擴(kuò)增、純化、回收S1基因片段，通過(guò)BamH Ⅰ和NheⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切后插入Peak13CD5LTEVhIgGFc真核表達(dá)載體，構(gòu)建Peak13CD5LS1TEVhIgGFc重組質(zhì)粒，并添加便于蛋白純化的Fc標(biāo)簽，克隆片段通過(guò)序列分析進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.2 穩(wěn)定表達(dá)克隆細(xì)胞株的構(gòu)建與重組蛋白的純化 重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒用AvrⅡ酶切線性化后純化回收，用脂質(zhì)體（NeofectTM DNA transfection reagent）轉(zhuǎn)染至HEK293E細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，將其換至終濃度分別為0.6 μg/mL、0.8μg/mL、1.0 μg/mL 和 1.2 μg/mL 嘌呤霉素藥物培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，3-4 d后將存活的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)至新的細(xì)胞培養(yǎng)液中，繼續(xù)加入高濃度嘌呤霉素藥物培養(yǎng)，并挑選單個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)至96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，取克隆細(xì)胞株的上清液進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，分析不同克隆細(xì)胞株的融合蛋白表達(dá)情況，將篩選出的高表達(dá)融合蛋白的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

陽(yáng)性克隆細(xì)胞株大量擴(kuò)增培養(yǎng)2-3 d后，回收細(xì)胞上清液，4℃，4 000 r/min離心30 min，取上清，采用0.45 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾。重組S1-Fc融合蛋白利用Protein A親和柱進(jìn)行純化，同時(shí)，AcTEV 蛋白酶切重組S1-Fc融合蛋白，酶切后的蛋白溶液流過(guò)Protein A親和柱，收集流出液獲得切除Fc標(biāo)簽的S1蛋白。向純化的蛋白溶液中添加苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonane fluoride，PMSF）與二硫蘇糖醇（ Dithiothreitol，DTT）至終濃度分別為1.0 mmol/L，超濾濃縮后，進(jìn)行SDS-PAGE與Western blotting分析，用BCA法來(lái)測(cè)定蛋白濃度，蛋白保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 動(dòng)物接種 取6-8周齡的BALB /C小鼠，隨機(jī)分為4組，每組5只。其中，第1組，每只小鼠腹腔注射20 μg 重組S1-Fc融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑的混合物；第2組，每只小鼠后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射100 μg 重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒；第3組，每只小鼠腹腔注射20 μg 重組S1-Fc融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑的混合物，同時(shí)后腿肌肉內(nèi)側(cè)注射100 μg重組 Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒；第4組，小鼠腹腔注射200 μL生理鹽水作為對(duì)照組。每隔1周用同樣劑量的樣品再次接種，共接種3次，每次接種1周后小鼠尾靜脈取血，4℃，2 000 r/min離心10 min，分離血清并保存于-80℃。

1.2.4 Western blotting驗(yàn)證接種小鼠是否產(chǎn)生抗S1血清 將不同接種方式接種28 d后獲得的小鼠血清分別稀釋成1 000倍和2 000倍，以10 pmol和1 pmol重組 S1-Fc融合蛋白作為抗原，通過(guò)Western blotting檢測(cè)接種小鼠血清中是否存在抗S1血清。以人源IgG Fc抗體作為抗S1血清的陽(yáng)性對(duì)照，埃博拉病毒GP1-Fc融合蛋白作為抗原的陰性對(duì)照。

1.2.5 ELISA檢測(cè)抗S1血清的滴度 用PBS將抗原（重組S1-Fc融合蛋白）稀釋成50 μg/mL的包被液，包被96孔酶標(biāo)板，每孔100 μL，4℃冷室靜置過(guò)夜，移去包被液，用PBS清洗檢測(cè)板3次，3 min/次；用pH 7.4，5%濃度的 BSA進(jìn)行室溫封閉，1 h后移去封閉液，用PBS清洗檢測(cè)板3次，3 min/次；用人源IgG Fc抗體作為抗S1血清陽(yáng)性對(duì)照，取接種生理鹽水組小鼠的血清作為抗S1血清陰性對(duì)照，將接種小鼠血清以1∶500開始采用pH7.4，含5% 濃度BSA的PBS梯度稀釋，室溫孵育2 h。移去待測(cè)抗S1血清，用PBS清洗檢測(cè)板3次，3 min/次；加入1∶10 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，室溫孵育2 h，移去山羊抗小鼠IgG抗體，用PBS清洗檢測(cè)板3次，3 min/次；加入100μL 1×YMB ELISA Substrate Solution于室溫下避光顯色反應(yīng)5 min，5 min后每孔加入50 μL終止液終止反應(yīng)。于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，630 nm作為參考波長(zhǎng)。采用單因素方差分析組內(nèi)樣本間顯著性，P＜0.05為差異顯著，采用GraphPad Prism 7 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 包含MERS-Co V S1基因的Peak13重組表達(dá)載體的構(gòu)建及酶切鑒定

用限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI雙酶切鑒定克隆了MERS-Co V S1基因的Peak13CD5LTEVhIgGFc重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖1所示，克隆片段大小符合插入目的基因的大小，DNA測(cè)序結(jié)果證實(shí)MERS-Co V S1基因序列成功插入了載體的正確位置，且沒(méi)有突變發(fā)生。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pEAK13CD5LS1TEVhIgGFc的雙酶切鑒定

2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及重組蛋白的表達(dá)與純化

采用限制性內(nèi)切酶AvrⅡ酶切Peak13CD5LS1TEVhIgGFc重組質(zhì)粒，使其線性化，載體與切下條帶已完全分開，切膠純化回收線性化質(zhì)粒載體。用脂質(zhì)體（NeofectTM DNA transfection reagent）線性化重組質(zhì)粒至已長(zhǎng)至80%的HEK293E細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)液，并加入不同濃度的嘌呤霉素以篩選穩(wěn)定表達(dá)的克隆細(xì)胞株。終濃度為0.8 μg/mL嘌呤霉素篩選得到的克隆細(xì)胞株表達(dá)量最高，大規(guī)模的培養(yǎng)0.8 μg/mL嘌呤霉素篩選得到的穩(wěn)定表達(dá)的克隆細(xì)胞株。利用Protein A親和柱對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中的重組進(jìn)行S1-Fc融合蛋白進(jìn)行純化。考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果（圖2）顯示，純化獲得蛋白大小為122 kD，與預(yù)期的重組S1-Fc融合蛋白的大小一致。

圖2 重組S1-Fc融合蛋白純化的SDS-PAGE分析

2.3 Western blotting分析接種小鼠S1血清的滴度及特異性

分別接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒、重組S1-Fc融合蛋白、重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒3次后的小鼠，尾靜脈取血并分離血清，按照1∶1 000和1∶2 000的稀釋條件下檢測(cè)10 pmol和1 pmol的S1-Fc融合蛋白抗原。結(jié)果（圖3-A）顯示，3種不同接種方法均可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗S1血清，但不同的方法誘導(dǎo)的抗S1血清濃度存在差異。接種重組S1-Fc融合蛋白及同時(shí)接種S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS-1TEVhIgGFc質(zhì)粒的小鼠血清在1∶1 000的稀釋條件下可以通過(guò)Western blotting法明顯檢測(cè)10 pmol和1 pmol的S1-Fc融合蛋白抗原，但僅接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒小鼠所取得血清與10 pmol 重組S1 -Fc融合蛋白抗原可以明顯反應(yīng)，但與1 pmol S1-Fc融合蛋白抗原反應(yīng)較弱。

接種重組S1-Fc融合蛋白及同時(shí)接種重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒小鼠的血清在1∶2 000稀釋條件下可以通過(guò)Western blotting法明顯檢測(cè)到與10 pmol的S1-Fc融合蛋白抗原的反應(yīng)條帶，與1 pmol重組 S1-Fc融合蛋白反應(yīng)較弱，而僅接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒所取得的小鼠血清在1∶2 000的稀釋條件下能與10 pmol S1-Fc融合蛋白輕微反應(yīng)，完全檢測(cè)不到與1 pmol 重組S1-Fc融合蛋白的反應(yīng)（圖3-B）。因此，重組S1-Fc融合蛋白接種和重組S1-Fc融合蛋白及重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒聯(lián)合接種小鼠的免疫效果明顯優(yōu)于單純只接種重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒的免疫效果。

圖3-C結(jié)果顯示，接種重組S1-Fc融合蛋白后的小鼠抗血清在1∶1 000的稀釋條件下通過(guò)Western blotting法檢測(cè)只能特異性的檢測(cè)到重組S1-Fc融合蛋白和S1蛋白，無(wú)法與埃博拉GP1-Fc融合蛋白發(fā)生反應(yīng)。而在相同條件下，IgG Fc抗體能夠明顯檢測(cè)到10 pmol和1 pmol的重組S1-Fc融合蛋白。說(shuō)明接種小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了抗S1蛋白的特異性抗體。

圖3 Western blotting分析接種小鼠的抗S1-Fc抗血清滴度與特異性

圖4 初次接種不同時(shí)間小鼠抗血清的ELISA檢測(cè)

2.4 ELISA檢測(cè)小鼠免疫后抗S1血清滴度

小鼠接種不同成分后定期取血并分離血清，用純化的S1-Fc融合蛋白作為抗原，ELISA檢測(cè)接種小鼠血清中抗S1血清的滴度。從圖4可以看出，接種7 d后，質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc接種組小鼠的血清中均未檢測(cè)出抗S1血清，接種14 d后出現(xiàn)了少量抗S1血清，但與對(duì)照組比濃度未達(dá)到顯著水平，接種28 d后，該組小鼠血清中才出現(xiàn)了顯著高于對(duì)照組的抗S1血清濃度（P＜0.05）。而重組S1-Fc融合蛋白接種組、重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc聯(lián)合接種組小鼠在接種7 d后均產(chǎn)生了明顯的抗S1血清，接種21 d后，兩組小鼠血清中抗S1血清滴度達(dá)到極高的水平，極顯著的高于對(duì)照組（P＜0.0001）。接種重組S1-Fc融合蛋白與共同接種重組S1-Fc融合蛋白和重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc組的數(shù)值未見顯著差異，故而兩者的接種效果相同，但該兩種接種方法產(chǎn)生的抗S1血清滴度高于只接種重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc的數(shù)值。因此，在短期內(nèi)為達(dá)到高水平抗S1血清應(yīng)答，綜合考慮成本等因素，接種重組S1-Fc融合蛋白的效果較好。

3 討論

刺突蛋白是中東呼吸綜合征病毒表面重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一。S蛋白在病毒的吸附和穿入過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是MERS-Co V疫苗研究的主要靶抗原［13，15-16］。在感染過(guò)程中，MERS-Co V的S蛋白被切割成受體結(jié)合亞基 S1 和膜融合亞基 S2［12，17-19］。MERS-Co V S1亞基含有與宿主細(xì)胞表面蛋白二肽基肽酶4（DPP4）的受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域（RBD），介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合［12，15，17，23］，引導(dǎo) MERSCo V進(jìn)入宿主細(xì)胞。MERS-Co V RBD可以結(jié)合包括人，駱駝，白鼬和蝙蝠等在內(nèi)的不同宿主細(xì)胞的DPP4。但MERS-Co V的易感性與宿主物種存在極大關(guān)系［6，20-21］。

本文通過(guò)比較研究了接種重組S1-Fc融合蛋白、重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc以及二者聯(lián)合接種小鼠的抗S1血清水平，證實(shí)3種接種方式均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗S1血清，接種重組S1-Fc融合蛋白組和聯(lián)合接種重組S1-Fc融合蛋白和重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc組小鼠產(chǎn)生了高水平的抗S1血清，而只接種重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIg-GFc組的小鼠的抗S1血清水平明顯不如前兩者高。其原因可能是單純的重組質(zhì)粒接種小鼠后，小鼠體內(nèi)并不存在質(zhì)粒DNA的主動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程，即重組質(zhì)粒不能主動(dòng)進(jìn)入細(xì)胞，而重組質(zhì)粒必須輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi)才能被轉(zhuǎn)錄成mRNA，進(jìn)而誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)該抗原蛋白的體液免疫和細(xì)胞免疫，小鼠體內(nèi)合成抗原蛋白需要一定時(shí)間過(guò)程［22］。因此，短時(shí)間內(nèi)DNA接種所激發(fā)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度相對(duì)較弱，不足以引起足夠的免疫保護(hù)效果，在小型動(dòng)物的試驗(yàn)中可能會(huì)檢測(cè)到免疫反應(yīng)，但會(huì)因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物體型的增大，而DNA接種的免疫效果會(huì)降低，尤其對(duì)人類以及大動(dòng)物的免疫實(shí)驗(yàn)［24］。

此外，DNA接種免疫存在一定的不安全性，DNA接種的導(dǎo)入有可能會(huì)發(fā)生基因整合，激活內(nèi)源性原癌基因，或誘發(fā)染色體的不穩(wěn)定性，產(chǎn)生遺傳性或致癌反應(yīng)，該方法更適合在體外難以表達(dá)的蛋白，較多的適用于小型動(dòng)物［24-26］。蛋白質(zhì)疫苗抗S1血清稀釋1∶2 000時(shí)仍能夠很好的檢測(cè)到1 pmol的S1-Fc抗原蛋白，結(jié)果顯示蛋白疫苗產(chǎn)生體液免疫的免疫效果更為快速，該蛋白質(zhì)疫苗在MERS CoV研究中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了高效表達(dá)重組S1-Fc融合蛋白的重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HEK293E細(xì)胞后獲得了可穩(wěn)定表達(dá)重組S1-Fc融合蛋白的克隆細(xì)胞株，并通過(guò)Protein A親和柱純化獲得了高濃度的重組S1-Fc融合蛋白。小鼠分別接種重組S1-Fc融合蛋白、重組質(zhì)粒Peak13CD5LS1TEVhIgGFc以及重組S1-Fc融合蛋白和Peak13CD5LS1TEVhIgGFc后，在小鼠血清中均檢測(cè)到了特異性抗S1血清。但僅接種重組質(zhì)粒的小鼠體內(nèi)在第3次接種后才產(chǎn)生較高濃度的抗S1血清，而兩種包含S1-Fc融合蛋白的接種方式在首次注射后就出現(xiàn)了高滴度的抗S1血清，而且顯著高于只接種了重組Peak13CD5LS1TEVhIgGFc質(zhì)粒小鼠的抗S1血清水平。